青霉胞外纤维素降解酶系的糖蛋白组学分析和功能探索

Fungal extracellular enzymes have been used as important biocatalysts for centuries. Cellulose-degrading enzyme systems, in particular, have been widely applied in modern food, paper, textile and bioenergy industries. Therefore, it is necessary to continue improving their enzymatic properties. Previous research has shown that glycosylation plays critical roles in extracellular enzyme secretion, activity and stability. The studies of extracellular enzymes from Penicillium sp. showed that their glycosylation is environment-dependent, and commonly heterogeneous. Furthermore, glycosylation not only affects the stability and specific activity of these enzymes, but also their interactions with other protein components. Therefore, from in-depth glycomic studies on the extracellular enzyme systems from Penicillium sp., we can reveal the relationship between glycosylation pattern and enzyme function. This information is theoretically valuable and potentially applicable. .The goal of this project is to establish an efficient, site-specific glycosylation analysis protocol for fungal extracellular proteins, using modern glycomic methodologies and techniques, including hydrophilic interaction chromatography, Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, etc. By analyzing glycosylation site, glycan structures and their domain distribution of the Penicillium secretome, specifically the carbohydrate-active enzymes, we may predict the functional roles of glycosylation in enzyme activities. Systematic glycoproteomic studies will provide better understanding of its secreted protein compositions and their functions, and also inspire us to develop new methods and techniques for enzymatic property improvement.

真菌胞外酶系作为重要的生物催化剂，其应用具有悠久的历史。纤维素降解酶系在现代食品、造纸、纺织及生物能源领域有广泛用途，改善其酶学性质对其应用十分必要。研究发现，糖基化修饰对胞外酶的分泌、活性及稳定性具有重要影响。对青霉胞外酶系的研究显示，其糖基化受培养环境影响，微异质性广泛存在。糖基化修饰不仅可以影响其稳定性和比活力，还可以影响与其他组分的相互作用。因此，对青霉胞外酶系的糖基化进行组学层面的深入研究，揭示其糖基化的规律和功能，具有重要的理论意义和应用潜力。.本项目拟采用亲水相互作用色谱、高压液相-串联质谱联用等糖组学分析技术，建立高效的真菌胞外蛋白位点特异性糖基化鉴定方法。通过对青霉分泌体系，特别是碳水化合物活性酶系中的糖基化位点、糖链结构及区域化分布的分析，总结其对活性、功能的影响。系统分析其糖蛋白组学可以加深我们对分泌蛋白组分结构、功能的认识，帮助发现和发明新的酶系改造方法和技术。

利用木质纤 维素类生物质降解转化生产液体燃料和化学品是保障人类社会可持续发展的重要途径。草酸青霉（Penicillium oxalicum）可产生完整的降解植物细胞壁多糖的木质纤维素降解酶系，有效地将木质纤维素水解成可溶性糖，用于生物燃料和多种化工产品的生产。蛋白质的糖基化修饰在生命体中起着重要的作用，探索蛋白质的N-糖基化在纤维素降解真菌中的生物学功能，将加深对糖基化相关酶类功能和底物选择性的认识，有助于总结真菌胞外分泌蛋白组中众多酶组分的糖基化修饰状态规律，为人工调整糖基化结构，提高纤维素降解酶的产量和生产特定N-糖链的纤维素降解酶提供新的思路。.本课题以草酸青霉为研究对象，利用遗传学手段，对四种蛋白质糖基化途径中的糖苷酶（葡萄糖苷酶2beta，甘露糖苷酶1、2和3）进行了敲除，通过对比野生型和敲除株的表型和酶学性质，发现甘露糖苷酶1的敲除严重影响蛋白分泌，使草酸青霉几乎丧失纤维素降解能力，而另外三个敲除株能显著提高草酸青霉的胞外蛋白的分泌，成倍提高纤维素酶和淀粉酶活力。非标定量蛋白组学分析显示，主要纤维素酶水平普遍有成倍提高，个别蛋白提高水平甚至达到10倍以上。糖蛋白组学分析显示，除甘露糖苷酶1因胞外蛋白含量太少未能有效测量外，其他三个敲除株较野生型普遍含有更长的N-糖链结构。为进一步研究糖基化对酶活的具体影响，水解纤维二糖的葡萄糖苷酶BGL1被分离纯化，经实验对比，敲除株的最适反应温度、热稳定性和比活力均有一定提高，其中N-糖链最长的葡萄糖苷酶2beta敲除株提高幅度最高，最适催化反应pH范围却有一定幅度的收窄。.实验证明，通过对糖基化途径中的基因进行遗传操作可以有效改变草酸青霉胞外酶系的糖基化结构，促进或抑制蛋白分泌，影响酶活及稳定性。未来将进一步验证该策略在其他草酸青霉菌株乃至其他丝状真菌中的有效性，为进一步提高纤维素酶转化生物质的效率提供新的途径。