γδT细胞受体识别结核杆菌蛋白抗原DXS2的分子机制及DXS2和EP肽活化的γδT细胞功能研究

Looking for appropriate immunogen is one of urgent issues need to be addressed in the area of tuberculosis. In view of the fast and effective anti-TB immune response of the γδT cells activated by protein antigen, it is of great significance to find γδT cells recognized antigen or epitopes and to clarify the mechanisms of immune protection for the research and development tuberculosis immunogen component based on the γδT cells. The novel strategy we have established to pan peptide and proteins antigens using tuberculosis specific γ δ TCR transfected cells confirmed that γ δ T cells could recognize the protein antigen. In addition, using the γ δ TCR transfected cells with the predominant pulmonary tuberculosis CDR3 sequence as probe to screen a 12-mer random-peptide, we obtained γ δ T cells-recognized tuberculosis protein antigen DXS2 and EP peptide, which have the function of activating γ δ T cells in the peripheral blood of patients with pulmonary tuberculosis. In this study, the recognition mechanism of γδT cell receptor to DXS2 and the biological function of DXS2 and EP- activated γδT cells would be further investigated. It would lay the foundation for developing effective tuberculosis immunogen based on γδT cells.

寻找合适的免疫原是当前结核领域需要迫切解决的问题之一，鉴于蛋白抗原活化的γδT细胞快速及有效的抗结核免疫效应，因此，寻找γδT细胞识别的蛋白抗原或抗原表位并阐明其免疫保护机制对研发基于γδT细胞的结核免疫原成分具有重大意义。我们前期建立了以结核特异性γδTCRCDR3 序列转染细胞系筛选结核杆菌蛋白抗原和表位的新方法，确证了γδ T 细胞可识别蛋白抗原并以此转染细胞系为探针，筛选噬菌体随机肽库获得了γδ T 细胞可识别的结核杆菌蛋白抗原DXS2 和EP 肽，证实其能够活化肺结核病人外周血γδT细胞，本研究中我们通过对γδT细胞受体识别结核杆菌蛋白抗原DXS2 分子机制及DXS2和EP肽活化的γδT细胞的生物学功能研究，深入探索DXS2和EP肽活化的γδT细胞免疫增强功能，从而在理论上丰富对γδT细胞识别机制的认识，也为研发潜在的基于γδT细胞的有效结核免疫原提供依据。

肺结核是严重危害人类健康的全球性重大传染病之一。免疫保护机制不清和缺乏有效的免疫原是结核病防控的重要限制因素。γδ T细胞介导的免疫保护应答在抗结核杆菌感染中发挥重要作用。基于γδ T细胞的在抗结核免疫应答中的作用开发结核疫苗为结核病的防控提供了一个新的思路。已经有研究表明结核分枝杆菌中的一些蛋白抗原可以有效活化机体内的γδ T细胞并诱导针对结核杆菌的保护性免疫应答。我们前期的研究发现了活动性肺结核患者体内的一种优势CDR3序列，根据这一序列和我们建立的反向疫苗学方法，我们成功的鉴定到了一种结核杆菌蛋白抗原，该抗原不仅能够被γδ T细胞识别还能够活化γδ T细胞。但是，这种基于传统的PCR技术的筛选方法低通量，得到的关于结核杆菌感染后机体免疫组库变化的信息及筛选得到的优势γδ TCR CDR3序列信息有限。在本课题中，我们通过二代测序的方法研究了活动性肺结核患者外周血中γδ TCR免疫组库的变化情况，发现在活动性肺结核患者体内，γδ TCR CDR3δ 序列的多样性有增加的趋势，而γδ TCR CDR3γ的长度又增加的趋势；在活动性肺结核患者体内，表达Vγ9-JγP γ链的γδ T细胞数量显著增加。除此之外，我们还筛选得到了一些新的优势CDR3序列，相比通过传统的PCR方法筛选得到的序列相比，我们相信这些序列更具有代表性。这一研究是我们对活动性肺结核患者体内γδ T细胞TCR免疫组库的变化情况有了比较全面的认识，同时为我们下一步使用反向疫苗学的方法筛选疫苗或者疫苗佐剂提供了一定的信息。我们还尝试通过结构生物学的方法了解γδ TCR识别多肽抗原的机制，我们使用哺乳动物细胞表达系统表达了γδ TCR，通过亲和层析和分子排阻等纯化方法得到了可以用于晶体筛选的蛋白质，通过筛选和优化得到了能够用于X射线衍射的晶体，经过X射线衍射后发现分辨率大约在4.0 Å，不能用于晶体结构的解析，目前我们正在进一步筛选和优化条件，争取尽快拿到可以用于结构解析的X射线衍射数据。