嗜热芽孢杆菌转座子突变体库的构建及产香机理研究

利用携带Mini-Tn10转座子的pIC333构建产酱香嗜热芽胞杆菌的转座子突变体库，筛选出高产酱香和低产（或不产）酱香的突变体，通过风味化学和现代色谱分析技术对比分析它们的发酵产物，可分析出该嗜热芽胞杆菌产生的主要特征香气成分及其在不同突变体中的变化情况。与此同时，根据突变体中插入的Mini-Tn10转座子序列获得该突变体被中断的基因序列，并对这些基因进行生物信息学分析和功能验证，找到与这些酱香特征香气成分相对应的基因，可在基因水平探讨嗜热芽胞杆菌产生酱香的分子机理，并进一步分析其主要代谢途径，找到其调控方法。.本项目可为从源头上确定酱香型白酒特征酱香风味物质及其产生原因提供科学依据，具有重要的理论意义，还可用为产酱香功能微生物的定向基因改造提供方向，有望获得产香、产酶性能更优异的基因工程菌，不仅能应用于酱香型白酒生产中，还可应用于其他酱香新产品的开发。

本课题研究酿酒微生物的产香机理。首先对酒曲中的微生物进行分离和鉴定，分析了嗜热芽孢杆菌、青霉、酵母的酿造性能，特别是其产香或产酯酶的性能。研究了产香主要功能菌嗜热芽孢杆菌的形态和生长特性。嗜热芽孢杆菌产生的主要香味成份有：糠醛、3-甲基丙醛、苯乙醛、三甲基吡啶、苯乙醇、苯甲醛、吲哚和4-乙烯基愈创木酚。分析嗜热芽孢杆菌对抗生素的抗性， 以pMarA333质粒构建具有氨苄抗性的阻断载体。构建的载体转化嗜热芽孢杆菌，涂布含有红霉素或氨苄霉素的平板，筛选能在氨苄霉素平板上生长，不能在红霉素平板上生长的突变子，构建突变体子库，分析筛选得到的各个突变子的产香气性能。提取产香性能有较大变化的突变子的基因组，用Tail-PCR技术进行基因定位，确定了与产香性能紧密关联的基因。嗜热芽孢杆菌的糖基转移酶基因敲除后，糖醛、3-甲基丙醛的含量下降约60%左右，4-乙烯基愈创木酚含量上升42.2% ； 新磷脂合成酶基因敲除后吲哚含量上升30%， 三甲基吡啶含量上升58.1%；通透性酶基因敲除后，苯乙醛含量下降40.3%，苯乙醇含量下降 42.0%，苯甲醛含量下降45.0%、吲哚含量下降62.8%、4-乙烯基愈创木酚含量下降73.3%，肽合成酶基因敲除后糖醛含量上升41.9%，三甲基吡啶含量上升72.5%。本研究阐明了与香味成份产量密切关联的基因，为优异产香功能菌的构建提供了重要的指导意义。本研究获得的菌株应用在白酒酿造中，提升了白酒的品质，体现了较好的实用意义，完成了该项目书的预定任务。