双酶孔径梯度杂化整体蛋白质在线酶反应器研究

本课题综合膜基与整体材料在线固定化酶反应器的优势，将整体材料结构均匀、孔径可调的优点与纳米材料的高比表面积结合，以整体基质的可控网络结构为支架，添加具有不同表面性质的纳米材料，制备梯度孔径杂化整体基质；通过在纳米材料和整体基质表面引入相同或不同蛋白酶，设计双酶孔径梯度杂化整体蛋白质在线固定化酶反应器。引入超分子模板可有效控制孔径及其分布，纳米粒子通过主客体之间的包结、共晶、配位等弱相互作用自组装于整体多孔材料中，可以提供从分子到超分子水平极大范围的分子识别功能。纳米材料的加入将显著增大整体材料的比表面积，增加蛋白质与酶接触的机会，提高酶解效率；而随着孔径的梯度变化，保证只有一定尺寸的肽段能够进入下一级孔中进一步酶解，从而在避免已分离区带扩散与混返的同时有效提高酶解效率，并确保仅有肽段能够进入质谱检测器，大大提高质谱检测的准确度；而双（多）酶解，也能够便利地进行膜蛋白等功能蛋白的在线酶解。

分别制备了添加SBA-15纳米颗粒的有机-无机杂化整体基质和添加棒状、球形、蠕虫状纳米颗粒的聚甲基丙烯酸酯整体基质；通过在纳米材料和整体基质表面引入相同或不同蛋白酶，设计单/双酶杂化整体蛋白质在线固定化酶反应器。纳米粒子通过主客体之间的包结、共晶、配位等弱相互作用自组装于整体多孔材料中，显著增大整体材料的比表面积，增加蛋白质与酶接触的机会，提高酶解效率；而通过控制整体基质的孔径，保证小于一定尺寸的肽段能够流出固定化酶反应器，从而在避免不完全酶解的同时有效提高酶解效率，并确保仅有肽段能够进入质谱检测器，大大提高质谱检测的准确度。而通过共价交联和螯合等温和固载方式分别将胰蛋白酶和糜蛋白酶固载在整体基质和纳米材料表面，成功实现了并联模式的双酶酶解；通过将两个固载了不同酶的酶反应器串联使用也获得了串联模式的双酶酶解。双酶酶解显著增加了较难酶解的膜蛋白等功能蛋白的在线酶解效率和质谱识别准确性，通过对鼠肝蛋白、膜蛋白、血清蛋白的应用也说明双酶反应器对不同分子量和疏水性的蛋白都具有良好的普适性。而与自由溶液中的双酶酶解方法相比，除了酶解效率增加外，酶解时间从24小时减少到50秒。