不吸水链霉菌中与四霉素和制霉菌素生物合成相关的PAS-LuxR家族调控子独立调控机制的研究

In this study, the independent regulation of PAS-LuxR family regulators in the biosynthesis of tetramycin and nystatin in Streptomyces ahygroscopicus was studied by means of gene cross-complementation, RT-PCR, EMSA and promoter modification to clarify the precise regulation mechanism of PAS-LuxR family regulators. Research contents include: the effect of the concentration of PAS-LuxR family regulators on their independent regulation; binding ability of natural regulators and binding sequences in vivo; the effect of 20 more amino acid residues at amino terminus 25-43 position of the PAS region of TtmRIV on the binding level; the influence of the -5th and 4th position bases and the -7th and 6th position bases on the binding effect; regulation level of TtmRIV on the these genes after the modification of promoter. The clarification of regulation mechanism of PAS-LuxR family will lead deeper understanding of regulation in biosynthesis of polyene macrolide, and lay the foundation for directional breeding by accurate regulation.

本研究以不吸水链霉菌为材料，通过基因交叉回补、RT-PCR、EMSA、启动子修改等方法，研究不吸水链霉菌中PAS-LuxR家族调控子在四霉素和制霉菌素生物合成中的独立调控问题，以阐明PAS-LuxR家族调控子精确调控机制。研究内容包括：1、PAS-LuxR家族调控子浓度对其独立调控的影响；2、天然的调控子和结合序列在体外结合能力；3、TtmRIV中PAS区域的氨基端25~43位氨基酸较其它调控子多的20个氨基酸残基对结合的影响；4、确定结合位点上-5/4位和-7/6位碱基对结合效果的影响；5、TtmRIV对改造启动子后的基因的调控情况。PAS-LuxR家族调控子在不吸水链霉菌中独立调控机制的明确，有利于对多烯大环内酯类抗生素生物合成中的调控更深入地认识，并且为此类抗生素利用精确调控定向育种奠定理论基础。

不吸水链霉菌次级代谢产物包括四霉素、制霉菌素两种多烯大环内酯类抗生素，二者生物合成途径极为相似，合成所需前体也相同，并且生物合成过程中均存在一个PAS-LuxR家族调控子（四霉素：TtmRIV；制霉菌素：NysRIV）。但是，功能保守、且能够互相代替的PAS-LuxR家族调控子在不吸水链霉菌中却发挥着独立调控的功能，现象罕见，其精确调控的机制并不清晰。本研究针对两个PAS-LuxR家族调控子独立调控机制的关键科学问题，利用位点特异性重组手段将天然的调控子和合成的调控子在野生型菌株中过表达、在阻断菌株中交叉回补考察浓度对调控子功能的影响，通过EMSA方法分析了天然调控子和合成调控子对目的基因的结合能力。最终确定PAS-LuxR家族蛋白精确调控作用由PAS区域主导；NysRIV或NT浓度增加后，会对多烯类产物有负调控作用；TtmRIV来源的PAS更有利于调控子与目的基因结合，这与四霉素是主要多烯类产物的实际一致；结合力更强的PAS-LuxR家族调控子在浓度增加后可对NysRIV的功能互补。调控子的精确调控是维持不吸水链霉菌代谢稳定的因素之一，阐明PAS-LuxR家族调控子在不吸水链霉菌中独立调控的问题，有利于更深入地理解多烯大环内酯类抗生素生物合成中的调控、更全面的认识链霉菌抗生素基因表达的精确调控情况；并且为在通过合成生物学手段高效、定向合成新型抗生素中利用精确调控奠定理论基础，对新抗生素的研发产生积极的推动作用。