γ-/δ-长链酮酸还原酶的创制及在手性内酯香料合成中的应用

Optically pure alkyl-lactones are important chiral perfumes, and synthesis of these compounds by biological method has great commercial value. Enzymatic asymmetric reduction of γ-/δ-keto aliphate, followed with lactonization is a green synthetic route for preparation of chiral lactones with great advantage as short route. But so far, the key reductase catalyst for efficient asymmetric reduction of keto aliphate with long chain was lack, which severely restricted the application of this route in industry. So creation of efficient keto-aliphate reductase with high stereoselectivity has significant importance on solving the restricting bottleneck in green synthesis of chiral alkyl-lactone. In this project, novel long-chain keto-aliphate reductase will be mined from genome database and engineered efficiently. The effects of chain length, carbonyl position and carboxyl group on the catalytic activity and stereoselectivity will be resolved. Based on these works, an efficient long chain keto-aliphate reductase will be created, and then a cascade enzymatic reaction will be performed coupled with lipase to create a novel process for preparation of lactone perfume by combining enzymatic reduction of γ-/δ- keto-aliphate and then lactonization. The realization of the objective will have great significance on production of chiral green perfume and ensurance of the food safety.

光学纯的烷基内酯是一类重要的手性香料，其生物法合成具有重大商业价值。酶促γ-/δ-长链酮酸(酯)不对称还原，随后内酯化制备手性内酯，路线短，绿色环保，优势显著。但是迄今为止，缺乏高效催化长链酮酸不对称还原的关键还原酶催化剂，严重制约了该路线的应用，因此创制高效、高立体选择性的长链酮酸还原酶，解决制约手性烷基内酯绿色合成的瓶颈问题，具有重大意义。本课题拟在前期工作基础上，从基因组数据库中挖掘新颖的长链酮酸还原酶并进行高效分子改造，揭示底物的链长、羰基位置以及羧(酯)基官能团对酶催化活性和立体选择性影响的规律及结构机理，创制高效的香料行业长链酮酸还原酶，进而与脂肪酶进行双酶反应耦合，创建一条新颖的γ-/δ-长链酮酸不对称还原与内酯化、制备烷基内酯香料的工艺路线。研究目标的实现，对于开创绿色手性香料生产的新局面，保障食品安全，具有重要意义。

光学活性的γ-/δ-内酯化合物是非常重要的香料化合物。生物催化4-/5-羰基酸(酯)不对称还原，然后分子内环化制备单一构型的γ-/δ-内酯化合物，具有反应条件温和，工艺路线简单，原料利用充分，是一条内酯香料绿色合成路线。然而受限于尚无高效还原酶序列报道，该路线的应用受到限制。.为破解催化剂的限制，在课题组前期通过土壤挖掘筛选获得羰基酸还原酶PpCR的基础上，以其为探针，对微生物4-/5-羰基酸(酯)还原酶进行了广泛的挖掘，筛选获得来源于沙雷氏菌的羰基酸还原酶SmCR，以及来源于酵母的羰基还原酶YKL071W和YIL124W。采用定向进化以及半理性设计改造的策略，对获得的酶进行分子改造，提高其催化反应效率。通过羰基还原酶SmCR的改造，获得四点突变体SmCRV4，比活力较母本提高86倍，催化效率提高110倍；对羰基还原酶YKL071W进行改造获得催化效率提高2.6倍的突变体L134S。对突变体SmCRV4进行了纯化和性能表征。突变体SmCRV4对碳链长度为8-12的4-/5-羰基酸(酯)均有显著活性，其中对4-羰基癸酸甲酯具有最高的活性，以及优良的立体选择性。.以突变体SmCRV4为催化剂，对酶催化4-/5-羰基酸(酯)还原反应以及还原产物4-/5-羟基酸(酯)环化过程进行了条件优化，构建了高效绿色的手性内酯合成工艺路线，高效制备了8种手性γ-/δ-内酯化合物，其中6种烷基γ-/δ-内酯是重要的香料化合物，而两种含苯环的γ-/δ-内酯是重要的药物中间体，反应转化率达到98%，内酯产物的ee值均高于95%。在(R)-γ-癸内酯的制备反应中，底物上载量可高达1.0 mol/L，时空产率高达1175 g/L/d。研究工作对于内酯香料的酶法绿色工业生产具有重要的经济价值。