鸡慢性冷应激启动Nrf2抗氧化信号传导路径的研究

持续冷应激通过复杂的生理生化途径严重影响家禽生长发育和生产性能的发挥。申请者前期研究发现，冷应激导致鸡体氧化应激症状典型，且应激后抗氧化应激反应转录因子NF-E2-related factor2 (Nrf2)下游的UGT1A6表达量急骤上升，表明Nrf2参与了这一过程。但Nrf2参与的鸡冷应激抗氧化应激信号传导下游路径目前尚不清楚。本项目以淮南麻黄鸡为试验材料建立试验用家系，通过免疫共沉淀结合深度测序技术分析鸡在受到慢性冷应激后，机体发生氧化应激反应并激活肝脏组织Nrf2调节抗氧化基因表达，及抗氧化类蛋白的下游作用分子，从而构建鸡冷应激响应启动的Nrf2抗氧化应激信号传导级联反应路径。项目研究成果不但有助于丰富鸡冷应激基因调控网络，而且挖掘的信号分子有助于抗冷应激功能基因的研究，为调控动物抗冷应激以及开发分子标记辅助选育抗寒新品种提供重要的科学依据。

本项目通过体内结合体外试验，再次证实鸡冷应激启动Nrf2/ARE信号途径的抗氧化应激，以及Nrf2/ARE下游信号分子。项目以收录于《生物多样性公约》的淮南麻黄鸡为研究对象，分析其在受冷应激过程中的生理生化反应。同时，建立具有一定亲缘关系的试验用群体，冷应激各时间点取肝脏组织冻存，体外培养鸡肝脏原代细胞，10 µM 二甲基甲酰胺（Dimethyl fumarate, DMF）处理12小时后，ChIP法检测并重新预测了Nrf2调节基因的结合序列。根据Nrf2结合序列在全基因组上的分布，获得Nrf2可能的调节基因14个。为进一步研究靶基因下游信号分子。试验选取UGT1A1，采用CoIP方法分析UGT1A1的下游作用信号分子，nano LC-ESI-MS/MS分析与UGT1A1结合的蛋白分子。研究结果表明，鸡冷应激6天内，血浆NO含量在3小时出现1个高峰，血浆中激酸激酶（Creatine kinase, CK）含量在3小时上升至最高，随后一直处于正常水平。HSP70 mRNA表达存在组织特异性，肝脏、心脏及肌肉中HSP70 mRNA呈现出2个表达高峰，分别在3小时前和72小时以后，前一个表达高峰起源于血浆中NO含量的上升，后一个表达高峰则由于鸡受长时冷应激后加强能量代谢产生，高表达HSP70结合低水平CK可保护细胞免受冷应激损伤。试验重新分析并获得冷应激条件下Nrf2的下游作用基序，与Nrf2核心基序的序列高度一致。以14个氧化应激应答基因中的UGT1A1为研究对象，经nano LC-ESI-MS/MS测序发现，其下游相互作用分子为L-FABP。由此可见，鸡在受冷应激时，可产生抗氧化应激并启动Nrf2/ARE信号途径，进而上调L-FABP表达，以消减脂质氧化代谢对细胞膜产生的损伤，并同时促进脂肪酸存贮以抵抗寒冷。项目研究进程中共发表学术论文4篇，其中SCI收录2篇，会议论文1篇；已投稿论文2篇。