光遗传诱导TrkB-内含体定向移动联合下调Lingo-1修复青光眼神经损伤的研究

Glaucomatous neuropathy induce neurodegeneration of both up- and downstream (retinal ganglion cells and visual cortex neurons), and there is no effective and definite treatment. Downregulating Lingo-1 has been proved to protect neural cells by increasing the quantity of TrkB and promote BDNF/TrkB signaling. However, downregulating Lingo-1 alone did not achieve ideal effect on repairing the optic nerve injury in optic nerve crush (ONC) animal model. This might be related to the TrkB endosomal trafficking which depends on the cytoskeleton. Based on our previous studies, we hypothesize that navigating the cytoskeleton and downregulating Lingo-1 could work together on repairing the injury in retina and visual cortex caused by optic nerve injury. This study aims to verify the synergistic effect of the TrkB endosome directional migration by optogenetics and Lingo-1 downregulation in retinal ganglion cells and in visual cortex neurons both in vitro and in vivo. This study would not only reveal the interrelationships of TrkB endosome and Lingo-1 but could also lead a new treatment of glaucomatous neuropathy both in retina and visual cortex.

青光眼神经损伤不仅影响视神经视网膜，也影响视皮质，严重危害视功能，且尚无有效治疗方法。在皮质神经元和视网膜神经节细胞（RGCs）的体外实验明显观察到，下调Lingo-1使依赖内含体运输的TrkB减少被分解，促进脑神经营养因子（BDNF）/TrkB信号通路，保障神经元和RGCs的存活。但我们的前期体内研究表明仅下调Lingo-1不能使视神经压伤动物得到理想疗效，推测与依赖于细胞骨架蛋白运输的TrkB-内含体在胞浆内运输的效率有关。本项目拟利用光遗传技术调控细胞骨架蛋白在体内外实验中系统观察TrkB-内含体定向移动联合Lingo-1下调在视皮质神经元和RGCs中的作用并研究其机制。本项目不仅揭示TrkB-内含体与Lingo-1的相互作用，也为青光眼视神经上下行损伤提供治疗新策略。

青光眼神经损伤不仅影响视神经视网膜，也影响视皮质，严重危害视功能，且尚无有效治疗方法。在皮质神经元和视网膜神经节细胞（RGCs）的体外实验明显观察到，下调Lingo-1使依赖内含体运输的TrkB减少被分解，促进脑神经营养因子（BDNF）/TrkB信号通路，保障神经元和RGCs的存活。但我们的前期体内研究表明仅下调Lingo-1不能使视神经压伤动物得到理想疗效，推测与依赖于细胞骨架蛋白运输的TrkB-内含体在胞浆内运输的效率有关。本研究在执行先前的的计划要点的同时，其研究结果主要分为以下5个方面：1.体内外实验明确抑制Lingo-1或经SP1促进Lingo-1降解可保护青光眼视神经损伤的RGCs及其轴突，并保护部分视功能，提示Lingo-1可能是视神经损伤的治疗靶点。2.通过免疫组化和单细胞测序发现青光眼视神经损伤（视神经钳夹伤和前房注射磁珠慢性高眼压模型）会导致对侧视皮质细胞活化星形胶质细胞增多，但不伴有神经元的凋亡、少突胶质细胞和小胶质细胞的激活，同时活化星形胶质细胞也被发现在上丘、外侧膝状体增多。 3.通过活体动物双光子连续观察实验明确青光眼视神经损伤会导致对侧视皮质锥体细胞突触结构可塑性下降。4.通过组织透明化技术结合光片显微镜明确青光眼视神经损伤会导致RGCs相关的逆行性神经回路变化，变化区域主要在下丘脑室旁核、膝状叶间核、腹侧外侧膝状核、中央杏仁核和基底外侧杏仁核，而Edinger-Westphal核、动眼神经核、前庭上核、红核、蓝斑核、巨细胞网状核、还有面神经核则无明显变化。 5.通过qPCR、WB和电镜等探讨了青光眼视神经可能的下行和上行损伤机制，RGCs损伤可能与能量代谢障碍和损伤有关，表现为胞内NAD+水平和ATP水平下降，LDH释放增加，且伴有对侧视皮质神经元的线粒体出现空泡、核基质液颜色变淡、线粒体肿胀、线粒体嵴的缺失断裂，而视皮质神经元损伤则与BDNF/TrkB信号通路下降以及自噬增加有关，通过玻璃体腔注射SIRT3激动剂honokiol则能对视皮质神经元线粒体起一定保护作用。 研究成果发表SCI论文4篇，8次在国内外眼科学术会议上进行交流，培养毕业博士研究生2名，在读博士研究生3名。