针对耐药性结核杆菌重要靶点蛋白质OtsB2的三维结构研究及耐药机制分析

Despite over a century of research, tuberculosis remains a leading cause of infectious death worldwide. Faced with increasing rates of drug resistance, the identification of genes that are required for the growth of this organism should provide new targets for the design of anti-mycobacterial agents. The disaccharide trehalose is the major free sugar in the cytoplasm of mycobacteria; it is a constituent of cell wall glycolipids, and it plays a role in mycolic acid transport during cell wall biogenesis. The pleiotropic role of trehalose in the biology of Mycobacterium tuberculosis and its absence from mammalian cells suggests that its biosynthesis may provide a useful target for novel drugs. Therefore, the OtsB2 protein, trehalose-6-phosphate phosphatase, is strictly essential for growth and provides a novel target for drug development. In this project, we will study the structure and biochemical assays of the OtsB2 and discuss the mechanism of anti-drug resistant Mycobacterium tuberculosis therapy. Based on the computer aided drug design, we will design and synthesis the small molecular compound, which could bound the active site specially and inhibited the OtsB2 acitivity, as a base for the anti-M. tuberculosis drug.

结核病是全球死亡率和发病率最高的传染性疾病之一，结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原。全球耐多药结核菌的出现和蔓延，对发展新型的抗结核药物提出了迫切需求。结核分枝杆菌的细胞壁成份独特，因而选取细胞壁合成的必需蛋白海藻糖磷酸磷酸酶 (OtsB2) 为研究对象。由于在人和哺乳动物体内没有OtsB2的同源蛋白，并且OtsB2编码基因otsB2是结核生长必需的，所以将OtsB2作为抗结核药靶。本课题采用多波长反常散射法 (MAD) 解析OtsB2的三维结构及OtsB2与底物磷酸根的复合结构，利用结构分析及缺失突变的方法确定OtsB2的酶活中心，从分子水平上阐明其生物功能和作用机制，并分析其耐药机制。利用计算机辅助药物设计的方法设计、合成与活性位点特异结合的小分子化合物，并通过酶活检测其对OtsB2活性的抑制作用，体外筛选到的能有效抑制结核分枝杆菌的小分子化合物可作为开发抗结核新药的基础。

结核分枝杆菌的全球控制是当今面临着的重大挑战。据报道，目前世界上二十多亿人口已感染结核分枝杆菌，每年近200万人口死亡，尤其是非洲等出现的结核分枝杆菌和艾滋病毒的合并感染（结核/艾滋病毒）增加了结核分枝杆菌的易感人群，以及在所有区域出现的耐多药 (MDR) 和广泛耐药 (XDR) 结核病，使疾病控制更趋复杂艰巨。因此，开发新的抗结核杆菌药物迫在眉睫。目前已开发的药物主要通过抑制其细胞壁，能量ATP和DNA的合成达到抗结核病的目的。由于结核分枝杆菌细胞壁中的海藻糖是保护结核分枝杆菌度过干早，炎热，缺氧等极端环境的必需二糖，且OtsB2被证明对于结核分枝杆菌的生长不可缺失，并且在哺乳动物和人中不存在同源基因，因此我们选取海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2，作为抗结核杆菌药物理想的药物靶点。本课题完成了OtsB2的表达、纯化、结晶及结构解析。OtsB2的结构解析对其作用机制的研究以及药物设计具有重要价值。另外，我们在研究抗结核病药物作用靶点蛋白的同时，还对一种抗病毒药物作用的靶点蛋白进行了研究。内罗病毒 (Nairovirus) 是一类RNA病毒，具有传染性强，致死率高等特点，能够引起多种严重的人类及动物传染性疾病。内罗病毒的基因组由三条负链RNA组成，分别为L片段、M片段、S片段。其中S片段编码核蛋白 (nucleoprotein，NP)。核蛋白在病毒的生命周期中具有重要作用，因此我们把核蛋白作为抗内罗病毒药物的靶点蛋白。我们解析了四种内罗病毒属不同血清型病毒核蛋白，分别为哈扎拉病毒核蛋白(Hazara virus NP，HAZV NP)、埃尔韦病毒核蛋白(Erve virus NP，ERVEV NP) 、库柏病毒核蛋白(Kupe virus NP，KUPV NP) 和克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus NP，CCHFV NP)。核蛋白结构与功能的研究在分子水平上为疾病诊断及药物开发提供一些新的线索。