错配修复介导的细胞凋亡相关蛋白的鉴定筛选及功能研究

Mediating DNA damage-induced apoptosis is an important genome-maintenance function of the mismatch repair (MMR) system. Defects in MMR not only cause carcinogenesis, but also render cancer cells highly resistant to chemotherapeutics, including alkylating agents (such as MNNG). To understand the mechanisms of MMR-mediated apoptosis and MMR-deficiency-caused drug resistance, we plan to analyze the differential changes at the level of protein expression and phosphorylation modification in MNNG-treated TK6 (MMR-proficient) and MT1 (MMR-deficient) cells by high-throughput quantitative proteomic approach. Our preliminary data demonstrate that a series of functional proteins are related to MMR-dependent apoptosis. In the future, we will explore the depth and breadth of proteome through more advanced LC-MS/MS analysis system, in order to discover more functional proteins involved in MMR-mediated apoptosis. Furthermore, we will focus on the validation of screened functional proteins, expecting to provide potential molecular target for the therapy of MMR-deficient cancer.

DNA错配修复系统（MMR）可以通过介导DNA损伤应答的方式诱导细胞凋亡，从而维持生物体内基因组稳定性。缺失MMR的细胞不仅易发生癌化，而且对化疗试剂（例如烷基化试剂MNNG）显现出极强抗性。为了探求MMR介导细胞凋亡的具体机制，我们计划通过高通量定量蛋白质组学方法研究TK6细胞（MMR野生型）和MT1细胞（MMR缺陷性）应对MNNG刺激后蛋白质表达量水平和磷酸化修饰水平发生的差异变化。我们的初期实验数据显示，一系列功能蛋白与MMR依赖型细胞凋亡调控密切相关。在后续研究中，一方面我们利用更先进的质谱分析系统拓展蛋白质组学数据的深度和广度，力求发现更多MMR依赖型细胞凋亡调控相关蛋白；另一方面我们采取分子生物学手段验证筛选出的功能蛋白，为MMR缺陷型癌症治疗提供潜在的分子靶标。

DNA错配修复系统（MMR）可以通过介导DNA损伤应答（DDR）的方式诱导细胞凋亡，从而维持生物体内基因组稳定性。在初期探索性实验中，我们利用 MNNG 刺激未同步化的 TK6 和 MT1细胞，在刺激四小时后收集蛋白样品进行质谱分析，得到一些初步数据，并验证了研究路线的可行性。为了进一步探求DNA损伤应答与细胞凋亡之间的关系，我们通过一系列技术方法的完善（包括：建立成熟的细胞周期同步化体系、优化细胞核分离技术、改进磷酸化肽段富集技术），并结合更加先进的质谱检测系统，得到了较为满意的结果，相较之前数据，我们定量到的蛋白数目和磷酸化位点数目有了大幅提升，平均增幅2倍。由于缺少相应的验证抗体，我们又开发了针对靶向蛋白质及磷酸化位点进行精准定量的质谱检测技术，并将其应用于蛋白质组学数据验证中。为了更加深入地阐明本研究中发现的PCNA这一重要蛋白的生物功能，我们构建了携带FLAG标签的稳转细胞系，通过免疫沉淀结合质谱检测的方法获得了在DNA损伤应答条件下PCNA相互作用蛋白的动态变化信息。