基于光场调控的光学成像新技术与应用研究

There has been increasing demands for optical imaging systems to improve their spatial resolution, data acquisition rate, field of view, phototoxicity and chemical selectivity. This project will target on developing novel imaging modalities and their applications in bio-imaging based on optical field engineering with the use of both fluorescence and label-free nonlinear four wave mixing/coherent Raman imaging contrast mechanisms. We will focus on: 1. Deep-tissue and high-speed imaging by using stimulated emission depletion (STED) principle; 2. Ultra-large field of view two photon fluorescence light sheep microscopy, where ultrashort laser pulse coherent control will be also investigated to improve the spatial resolution; 3. Nonlinear four wave mixing/coherent Raman optical diffraction tomography for high-speed three dimensional chemical imaging; 4. The biological applications of developed imaging modalities for in vivo microscopy with living zebrafish.

高空间分辨率、高成像速度、大视场、成像特异性以及低光损伤或光毒性是近年来光学成像新技术的主要发展趋势。本项目以光场调控物理为核心和技术手段，针对现有成像技术的不足，主要瞄准高空间分辨、高速大视场和长时程等生物成像领域关注的性能，涵盖荧光与无标记四波混频/相干拉曼特异性两个谱学信号特征，基于对光场振幅、相位及照明的调制，开展新型成像技术研究和其生物学应用。主要研究：1.为解决超衍射极限分辨荧光成像中，在样品深层高速/高分辨成像难点，发展高速STED深层样品超分辨成像技术；2.为解决光片显微镜中同时实现在极大视场下的高分辨率成像难点，发展超大视场高分辨双光子光片成像，同时结合脉冲激光相干控制，提高空间分辨率；3.克服传统线性光学衍射层析显微中难以实现特异性成像问题，发展高速三维非线性/拉曼衍射层析无标记成像技术；4.探索新显微技术在活体斑马鱼体系中的生物成像应用。

项目开展的研究以光场调控为核心创新驱动，面向生物成像应用，主要以解决生物活体细胞中高空间分辨率、大视场、高速以及长时程三维成像难点为研究目标，以光相位、振幅以及光照明调控为科学基础，利用一个或多种光场调控机制，以荧光标记和无标记光学信号形成互补的成像对比机制，发展新型成像技术及相关应用。项目实施中，完成了多种新型高时空分辨成像技术。并与项目组中生命科学领域成员课题组开展了深度、有机的交叉合作，以解决生物医学重大科学问题为引领发展新型成像技术。在时间分辨率上，实现了一种高速1Hz三维体成像和三分之一波长分辨率的无标记活细胞超分辨成像技术，并与超分辨荧光结合形成新型双模态成像技术(SR-FACT)。活细胞中，SR-FACT技术可以实现对特定荧光标记分子/蛋白在细胞全局形貌中的动态三维超高分辨成像观测。基于发展的显微技术，首次报道了一种新颖中性酸碱度的低折射率囊泡结构，并通过长达小时量级的连续双模态共定位成像数据，揭示了其生成和命运路径及组织细胞器相互作用的枢纽功能，命名为“黑色液泡小体”。在空间分辨上，实现了一种基于飞秒相干调控的超分辨荧光成像新技术，空间分辨率达到30nm；实现了基于波前调控的新型超分辨结构光照明显成像技术两项，发明新型解卷积算法，突破现有荧光显微系统的光学硬件限制，首次实现通用计算荧光超分辨率成像，实现目前活细胞光学成像中最高空间分辨率（60nm）下，速度最快（564Hz）、成像时间最长（1小时以上）的超分辨成像，解析了核孔蛋白动态过程。在成像应用方面，我们利用活细胞超分辨率成像预测佩梅病临床分型以及研究药物筛选方法，揭示线粒体对钙区传播顺序的决定机制以及beta细胞GCGR增强胰岛素分泌机制研究。项目执行以来，发表研究论文30篇，其中高水平论文10篇（含Nature Biotechnology 2篇，Light, science & applications 1篇，Science Advances 1篇，JACS 1篇，Science Bulletin 1篇，Nano Letters 2篇，Advanced Materials 1篇，eLife 1篇），申请专利5项，已授权 专利5项，其中申请美国专利1项并已获批。