基于“多热点”第二代缝隙增强拉曼探针的转移前哨淋巴结显影和鉴别

Sentinel lymph node (SLN) is the first stop of lymphatic metastasis in malignant tumor, which is of great importance for the understanding metastasis of lymph nodes in the malignant tumor area and the guidance of lymphadenectomy. However, there is a lack of ideal SLN agents and rapid intraoperative identification of lymph node metastasis. In this project, we propose a new method based on "multiple hot spots" new generation of gap-enhanced Raman tags (GERTs) for the imaging and identification of metastatic sentinel lymph nodes. Raman reporter molecules embedded in the internal and external "tiny nanogaps" of the nanoprobes are greatly enhanced due to the extremely strong electric field "hot spots" and chemical effects. Therefore, GERTs show the advantages including high sensitivity (single nanoparticle detectable), high photostability, high-speed (within 1 minute) Raman imaging in a large area, suitable particle size, high specificity, large tissue penetration depth and good biocompatibility. By using targeting and non-targeting “double nanoprobes” strategy, combined with machine learning data processing methods, we can achieve the direct identification of lymph node metastasis. Therefore, Raman imaging technique based on the second-generation GERTs paves the way to achieve intraoperative rapid and high-contrast imaging of sentinel lymph nodes and specific recognition of metastatic sentinel lymph nodes, thus improving the accuracy and efficiency of lymphadenectomy and reducing its postoperative complications.

前哨淋巴结是恶性肿瘤发生淋巴转移的第一站，对恶性肿瘤区域淋巴结的转移情况及指导淋巴结清扫具有重要意义，但还存在缺乏理想的淋巴结显影剂和无法快速术中鉴别淋巴结是否转移等问题。本课题拟通过全新的思路来设计一种基于“多热点”第二代缝隙增强拉曼探针的的转移前哨淋巴结的显影和鉴别方法。将拉曼报告分子内嵌在纳米探针内、外部的“极小缝隙” 中，缝隙中极强的电场“热点”和化学效应使得报告分子的拉曼信号实现极大增强，具有高灵敏度（单颗粒可测）、高光稳定性、大面积快速（1分钟内）拉曼成像以及粒径合适、特异性高、组织穿透力强、生物安全性好等优点；利用“靶向和非靶向双探针”显影策略，结合机器学习的数据处理方法，实现淋巴结转移状态的直接鉴别。因此，基于第二代缝隙增强拉曼探针的的拉曼成像技术有望实现术中对前哨淋巴结的快速、高对比度显影和对转移前哨淋巴结的特异性识别，从而提高淋巴清扫术的准确性和效率并降低其术后并发症。

前哨淋巴结是恶性肿瘤发生淋巴转移的第一站，对恶性肿瘤区域淋巴结的转移情况及指导淋巴结清扫具有重要意义，但还存在缺乏理想的淋巴结显影剂和无法快速术中鉴别淋巴结是否转移等问题。本课题成功制备外壳为花瓣状结构的“多热点”第二代缝隙增强拉曼探针（P-GERTs），其增强因子可高达5×10^9，并可实现单颗粒检测，并在单颗粒水平上表现出良好的信号均一性和光稳定性，单点采集时间仅为0.7毫秒/像素，可在较低功率（370微瓦）下6秒内获得高分辨单细胞拉曼成像（2500个像素），在52秒内获得高对比度大范围的小鼠活体前哨淋巴结成像，并阐明了“非共振”缝隙增强拉曼探针对材料光稳定性、拉曼背景信号等的影响机制。本项目进一步设计了靶向性与非靶向性两种P-GERTs探针，其内嵌不同的拉曼信号分子，但具有相近的粒径、表面电位和拉曼信号强度，保证淋巴结对两种GERTs的非特异性摄取量保持一致。对淋巴结进行拉曼成像，可重构其3D图像并获得靶向/非靶向探针的比值。通过比值可有效克服淋巴结非特异性摄取的问题，实现转移与非转移的鉴别，准确率高达87.5%，显著高于目前临床中使用的术中冰冻病理检查。该研究表明，基于拉曼成像的双探针比值法可为术者提供快速、准确的前哨淋巴结肿瘤转移原位光活检技术，有望代替术中冰冻病理检查并指导后续手术方案。.到目前为止已按照该项目计划全部按时顺利执行完所有的研究内容，并实现了预定的研究目标，对其中的关键科学问题展开了充分的探究并基本解决，也取得了一批研究成果，在Nature Communications（2），Advanced Science和Biomaterials等期刊发表了28篇科研论文，获批3个国家发明专利，申请7个国家发明专利，培养了3位博士后，培养毕业了5位研究生（2位博士、3位硕士），还有10位博士生和5位硕士生在读。有关缝隙增强拉曼探针的部分研究成果正在开展临床转化的应用开发，也为后续的科研合作和项目申请的成功获批奠定了坚实的基础。