基于DGGE技术的微生物生态学研究新方法的构建及其在红曲黄酒酿造体系中的应用

Denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）is one of the most important techniques for microbial ecology researches, which has been widely applied in microbial community analysis. However, some obvious defects have been found from our previous study in Hongqu glutinous rice wine brewing system. In this study, new microbial ecology methods based on DGGE will be developed according to the principles and characteristics of DGGE. Several strategies are proposed for improving DGGE method, including using sequences model databases for screening optimum PCR-DGGE primers for analyzing of microbial community, and single-double stranded complexes and end-melting fragments based on rDNA for getting more accurate and reliable microbial community information, and single-double stranded complexes and end-melting fragments based on rRNA for getting more accurate microbial metabolic activities information. Application of the new methods can provide a whole picture of microorganisms in Hongqu glutinous rice wine brewing system and reveal the mechanism of brewing. This project will not only provide new DGGE methods for microbial ecology analysis of traditional fermentation food systems, but also be a good idea for other microbial ecology research techniques (such as TGGE、 SSCP and so on), accordingly which is very important and useful for the whole microbial ecology research area. We will publish 10-12 papers, 5-8 among which will be published in SCI journals, and apply 3-5 patents.

变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是微生物生态研究的一种重要手段，已广泛应用于菌群结构的解析。然而，前期研究发现该技术在微生物生态研究中存在明显不足。因此，本项目籍红曲黄酒酿造体系，基于DGGE自身的原理和特点原创性地提出系列改进策略，包括以序列模式数据库策略选取最佳DGGE引物，以基于rDNA的单双链复合体和可末端熔解片段策略获取精准的菌群结构信息，以基于rRNA的单双链复合体和可末端熔解片段策略获取准确的菌群代谢活力信息，从而建立基于DGGE技术的微生物生态学研究新方法。应用新方法从微生物生态层面解析红曲黄酒酿造微生物体系，揭示其酿造机理。本研究不仅为传统发酵食品体系中微生物生态解析提供借鉴和参考，而且有望拓展到与 DGGE 具相似原理的TGGE、SSCP等研究手段中，这对于整个微生物生态研究领域具有重要意义。拟发表论文 10-12 篇（5-8 篇 SCI），申请发明专利 3-5 项 。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是微生物生态研究的一种重要手段，已广泛应用于菌群结构的解析。本项目针对 DGGE 技术在微生物生态研究中存在的不足，提出了系列改进策略。构建了红曲黄酒酿酒体系中微生物菌群的rDNA近全长序列模式数据库，应用于筛选适合于此体系微生物生态解析的PCR-DGGE引物；构建了基于单双链复合体和可末端熔解片段策略的DGGE定性分析方法，并在乌衣红曲微生态解析中进行评估与应用，获得了精准的菌群结构信息；尝试了以基于rRNA的单双链复合体和可末端熔解片段构建DGGE定量分析方法，但由于所获得的单双链复合体和可末端熔解片段浓度低，无法通过DGGE进行分析，因此，项目组调整策略，构建了基于PMA-qPCR和PMA-FISH技术的活菌定量检测的方法。最后，项目组应用构建的新方法结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）指纹图谱和高通量测序等方法，从微生态层面全面解析红曲黄酒酿造微生物体系，并分析主要真菌和细菌与红曲黄酒挥发性风味物质之间的相关性。.本研究不仅能为其他传统发酵食品体系中微生物生态解析提供借鉴和参考，而且可以拓展到与 DGGE 具相似原理的TGGE（温度梯度凝胶电泳）、SSCP（单链构象多态性）等微生物生态研究手段中，这对于整个微生物生态研究领域具有重要意义。项目组已发表和录用的论文 15 篇（其中被SCI 收录5篇，被EI收录10篇），获授权国家发明专利 7项，实审2项。