大肠杆菌抗3-苯基乳酸胁迫分子机制及其强化合成策略研究

3-Phenyllactic acid (PLA)，a kind of compound of phenylpropionic acid, will be widely applied in food, medicine and chemical synthesis industry for its various biological activity and chiral building block. In our previous study, a system for PLA biosynthesis was successfully developed by exogenous gene over-expression and cofactor regeneration in situ. However, high synthesis efficiency and conversion ratio can only be kept for several hours for the antimicrobial activity of PLA. It is necessary to obtain PLA stress-tolerance strains and study the mechanism of PLA stress response to solve the bottleneck. Accordingly, this program mainly including the following works: (1) screening PLA stress-tolerant strain by adaptive evolution; (2) disclosing the mechanism on high concentration of PLA stress-tolerance by iTRAQ technology; (3) validating the proposed mechanism and stress response elements function by gene knock-out and introducing recombinant genes. The elaboration of mechanism on PLA stress-tolerance and strategy study based on stress response elements regulation will provide new ideas for the yield and productivity enhancements of PLA or its analogues biosynthesis.

3-苯基乳酸（PLA）属于苯丙酸类化合物，因该化合物及其衍生物具有多种生物学活性，且是一种重要的手性砌块，有望在食品、医药、化工合成方面获得广泛应用。前期通过关键酶过表达及辅因子原位再生改造大肠杆菌，成功构建了高光学活性的PLA生物合成体系。但是PLA的抑菌活性导致重组菌株仅能在较短时间内维持高生产效率和转化率。因此，获得1株耐受高浓度PLA胁迫的菌株并研究其抗逆机理是解决该问题的有效途径。本项目主要进行如下研究：（1）采用适应性进化，筛选获得1株抗性菌株；（2）通过同位素相对标记与绝对定量技术（iTRAQ）分析抗逆菌株与出发菌株在PLA胁迫过程中的蛋白质组成与丰度差异，研究其抗逆机制；（3）通过Red重组敲除目标基因及导入重组基因验证抗逆元件及强化PLA合成策略的有效性。对于抗PLA胁迫机制的阐明及抗逆元件调控策略研究将为代谢工程强化大肠杆菌或者其它宿主菌合成PLA及其类似物提供新思路。

3-苯基乳酸（PLA）是一种发现于天然蜂蜜和发酵酸面团中的具有广谱抗菌活性的乳酸菌代谢产物。它的两种光学对映体属于苯丙酸类化合物，因该化合物及其衍生物具有多种生物学活性，且是一种重要的手性砌块，有望在食品、医药、化工合成方面获得广泛应用。项目前期通过关键酶过表达成功构建了PLA生物合成体系。但是PLA的抑菌活性导致重组菌株仅能在较短时间内维持高生产效率和转化率。本项目通过紫外诱变和适应性进化筛选获得一株能够在1g/L PLA胁迫下正常生长的大肠杆菌E. coli Z2016。通过对该菌株在PLA胁迫下的研究发现，突变株的胞内pH、细胞表面疏水性、菌体自聚集能力、静息细胞活力等指标与出发宿主菌相比有显著改善；以耐受性突变菌株为研究基础，进一步围绕提高酶催化效率、增强辅因子再生、强化细胞对D-PLA的耐受、减少反应体系中D-PLA的胁迫等综合策略，开发并成功证实了该策略用于强化D-PLA生物合成的有效性。项目研究获得了三个主要结果：（1）筛选并获得了1株能在1 g/L D-PLA胁迫下正常生长的大肠杆菌突变宿主，为进一步强化PLA的微生物合成提供了新的底盘菌株；（2）针对关键合成酶的改造、辅助因子的再生强化与融合、双相催化体系筛选与优化等不同方法，从多个方面综合研究和验证了强化大肠杆菌合成D-PLA及L-PLA的策略。研究结果证明了这些优化策略均能有效提高PLA的合成效率、底物转化率和产物产量。其中，利用耐受性突变宿主株和双相催化体系减少产物的持续性胁迫效果最优。这些部分策略的结合使D-PLA的产量由初期的12.2g/L提高到32.3g/L。相同的策略在合成高光学纯度L-PLA也取得了类似的有益效果；（3）提出并证实了L-PLA具有显著促进小麦生根、生长的作用，结合其广谱抑菌作用，PLA有可能作为广谱抑菌和植物生长促进双功能因子用于新型植物生长促进剂的开发。