转录因子Ste12调控玉米大斑病菌侵染过程的分子机制

We identified previously that conidia development, appressorium formation, toxin production and pathogenicity of Setosphaeria turcica were regulated by pathogenicity MAPK cascade, then we cloned the gene STE12 of transcription factor which was located downstream of MAPK in this pathway. The protein Ste12 had a Ste12-like specific domain by bioinformatic analysis, further, yeast two hybrid experiments showed that Ste12 interacted with Stk2, MAPK in this pathway. In this research, we will analyze STE12 expression pattern in pathogenicity through Real-time PCR, Western blot; the knock-out and RNAi mutants will be constructed, and these mutants was used to study the relationship between STE12 with pathogenicity of S. turcica; its target gene will be screened through transcriptome comparison analysis between wild type and knock-out mutant strains and ChIP (Chromatin Immunoprecipitation), and the function of target gene will be characterized by gene knock-out. The regulation of Ste12 in infection of S. turcica will lay a foundation to study the molecular mechanism of plant-microbe interaction and provide a new approach of fungal disease control.

本项目组前期研究明确了玉米大斑病菌Pathogenicity MAPK Cascade调控病菌分生孢子发育、附着胞形成、毒素的产生及致病力，并克隆了该条途径下游的转录因子STE12基因；生物信息学分析表明Ste12具Ste12-like特有的结构域，通过酵母双杂交技术明确了Ste12确与该途径的MAPK（Stk2）互作。本研究拟利用Real time-PCR、Western blot分析该基因在病菌致病过程中的表达模式；创制基因功能缺失和部分抑制突变体，通过分析突变体表型明确该基因与病菌致病性的关系；通过野生型及基因敲除突变体的转录组比较分析及染色质免疫共沉淀技术筛选Ste12作用的靶基因，进而创制靶基因的缺失突变体分析靶基因功能，明确STE12在玉米大斑病菌侵染过程中的调控机制。研究结果为深入探讨植物与病原物互作的分子机制和真菌病害防治的新途径奠定基础。

玉米大斑病菌是引起玉米大斑病的丝状病原真菌,我们前期研究发现该病菌中的Pathogenicity MAPK 级联途径参与调控病菌分生孢子发育、附着胞形成、毒素的产生及致病力，推测可能是通过其下游转录因子StSte12（计划书中为Ste12）来调控上述过程的,但其具体分子机制尚不清楚。本课题组按照项目计划书的要求，主要在3个方面进行了较为深入研究，并取得了阶段性的研究成果。主要研究结果如下：①StSte12表达模式研究：利用RT-PCR及Western blot技术分析了StSTE12的表达模式，发现该基因及其表达蛋白在菌丝体时期表达量最低，在分生孢子形成时期表达量居中，在附着胞形成时期的表达量最高。②StSTE12基因功能分析：利用同源基因功能互补分析，发现StSTE12基因可以回复酿酒酵母ScSTE12基因的功能，能够调控酵母细胞的侵入生长；创制了StSTE12基因敲除突变体和不同沉默水平的RNAi突变体，发现StSTE12正调控病菌的分生孢子产生、黑色素的合成、附着胞发育及侵染过程。③StSte12调控病菌侵染的分子机制分析：利用生物信息学技术预测了转录因子StSte12可能调控的下游靶基因共有2044个，着重对其中441个核心靶基因进行功能预测；利用染色质免疫共沉淀技术确定了StSte12的DNA结合位点并筛选了其下游靶基因，发现Homeobox基因家族部分成员和几丁质酶基因StCHS5受StSte12所调控，其中8个Homeobox基因家族成员负调控病菌分生孢子萌发、附着胞发育及侵染过程；进一步创制了StCHS5基因敲除突变体，分析发现StCHS5正调控病菌分生孢子形成、影响细胞壁的发育及病菌的侵入过程。总之，我们的研究数据表明，玉米大斑病菌转录因子StSte12通过调控几丁质酶基因StCHS5的表达来调控病菌的侵入过程。另外，本课题组目前正在利用RNA-Seq技术比较StSTE12基因敲除突变体与野生菌株在侵入过程中的转录本的差异，在后续研究中将利用上述数据深入阐示玉米大斑病菌StSte12调控病菌侵入的分子机制。