内质网应激通路IRE1α-XBP1诱导腹膜间皮细胞自噬在EMT中的发生机制及健脾益气方的干预效应

Impairment of peritoneal mesothelial cells is generally considered to be initiators during peritoneal fibrosis.To protect peritoneal mesothelial cells is an important target for preventing peritoneal fibrosis.Our previous study found deficiency of Pi Qi is the key to the pathogenesis of early peritoneal fibrosis,and Jianpi Yiqi Decoction can play the role of anti-peritoneal fibrosis by Intervention EMT process via blocking TGF-β/Smads signaling pathway.Study confirmed that autophagy participates in and induces PMC EMT changes, and endoplasmic reticulum stress(ERS) can induce autophagy in PMC,but the role of ERS induced autophagy in PMC EMT and its mechanism are not yet clear. This study is based on Jianpi Yiqi Decoction delay or reverse EMT by interventing autophagy of PMC induced by IRE1α-XBP1,which can activate the adaptive protection of PMC.By duplicating peritoneal fibrosis rats model and culturing human peritoneal mesothelium cells,using methods of gene transfection,RFP-GFP，western blotting,real-time polymerase chain reaction, transmission electron microscope and laser scanning confocal microscope.Elucidating the molecular mechanisms of Jianpi Yiqi Decoction delay or reverse EMT by interventing autophagy of PMC induced by ERS,which can provide new pathogenesis study and treating methods for peritoneal fibrosis using Traditional Chinese Medicine.

腹膜间皮细胞(PMC)损伤是腹膜纤维化(PF)的始动因素，针对PMC的保护是预防PF的重要靶点。我们前期研究发现，脾气亏虚是PD早期腹膜病变的病机关键，健脾益气方可通过干预TGF-β/Smads信号通路延缓EMT进程而发挥抗PF的作用。研究证实自噬参与并诱导了PMC EMT改变，而ERS可诱导PMC发生自噬,但ERS诱导的自噬在PMC EMT中的作用及其机制尚未明了。本项目基于健脾益气方可能通过调控内质网应激IRE1α-XBP1通路诱导的PMC自噬活性，激活PMC的适应性保护作用，延缓或逆转EMT进程。通过复制PF大鼠模型及HPMC EMT模型，应用基因转染、RFP-GFP法、RT-PCR、Western blot、透射电镜、激光扫描共聚焦显微镜动态成像等技术，阐明健脾益气方干预PMC ERS诱导的自噬，以延缓或逆转EMT的作用机制，为PF发病机制研究及中医药治疗提供新的思路和方法。

针对腹膜透析患者普遍存在腹膜间皮细胞EMT改变这一关键性科学问题，以腹膜间皮细胞内质网应激诱导的自噬与EMT关系为研究切入点，在中医理论指导下，结合现代医学对腹膜透析致腹膜间皮细胞内质网应激及EMT的机制研究，创新性的提出脾气亏虚是PD诱导腹膜损伤的主要病机，运用健脾益气方防治PD诱导的腹膜损伤。本项目通过开展体内实验和体外实验，阐明健脾益气方通过干预腹膜间皮细胞ERS通路IRE1α-XBP1诱导的自噬，激活其适应性保护作用，以减轻和控制EMT改变的作用机制。体内实验通过复制PD大鼠腹膜纤维化模型（假手术组除外），随机分假手术组、模型组、西药组、健脾益气方高剂量组、健脾益气方中剂量组、健脾益气方低剂量组，每天药物灌胃一次，连用30 d。研究结果发现，与假手术组相比，模型组腹膜致密层厚度及GRP78、pIRE1α、XBP1s、α-SMA水平明显升高( P＜0.05)，E-cadherin水平明显降低( P＜0.05)。；予健脾益气方干预后，大鼠腹膜纤维化病理及腹膜间皮细胞损伤程度得到明显改善，E-cadherin蛋白表达明显升高（P＜0.05），腹膜致密层厚度及GRP78、pIRE1α、XBP1s、α-SMA蛋白表达明显降低（P＜0.05）。体外实验通过体外培养培养人腹膜间皮细胞（HPMC），TGF-β1（5ng/ml）诱导制备HPMC EMT模型，分别阻断或激活内质网应激和自噬，观察对腹膜间皮细胞EMT、ERS通路IRE1α-XBP1标志分子及自噬标志分子表达的影响。研究表明：腹膜间皮细胞通过内质网应激通路IRE1α-XBP1诱导发生自噬、参与EMT的发生。予健脾益气方含药血清干预后，GRP78、pIRE1α、XBP1s、LC3-II、Beclin-1、α-SMA表达量降低，E-cadherin表达量升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。本项目研究表明，健脾益气方能有效保护腹膜间皮细胞、防治腹透相关性腹膜损伤的作用，其机制可能是通过干预腹膜间皮细胞内质网应激通路IRE1α-XBP1诱导的自噬，激活其适应性保护作用，以减轻和控制腹膜间皮细胞EMT。本项目研究成果为中医药防治PD纤维化，保护腹膜间皮细胞功能，防治腹膜损伤提供新思路和新方法。