青蒿琥酯对化疗耐受性涎腺腺样囊性癌作用的生物学效应及生物信息学研究

Perineural invasion, hematogenous metastasis and chemoresistance are the protrude character of the adenoid cystic carcinoma(ACC). Artesunate is reported to have tumor inhibition and chemoresistance reverse effect recently. In this project, multidrug resistance cell lines were attained through cisplatin induction from ACC parental cell lines such as NACC, SACC-83 and SACC-LM respectively. A series of in vitro and in vivo experiments on cellular morphology, structure, proliferation, cell cycle, apoptosis, invasion; tumor angiogenesis, tumor growth, metastasis; chemoresistance genes and proteins expression would apply to resistant cell lines after artesunate treatment. MTT assay, flow cytometry, transwell invasive assay, HUVEC scratch test, microvessel formation assay, athymic mice bearing tumor model, animal model tumor tissue immunohistochemistry, RT-PCR, Western Blot were project to detect the biological effect and expression of drug resistance related biomarkers within chemoresistance cell lines after artesunate treatment. High-throughput genome chip scanning and mass spectrometry detection are planned to screen genes and proteins from resistant cells and parental cells after artesunate interference. Compared the genes and proteins expression profile, identify the target sites of multi-drug resistance related genes and proteins expression under the drug treatment of artesunate through bioinformatics tools such as Gene Ontology classification and Tree View analysis. Select a couple of significance up-regulated and down-regulated genes to validating their functions with Western-Blot and RT-PCR technique ultimately.

腺样囊性癌(ACC)易沿神经侵袭、早期血行转移，化疗易耐药。青蒿琥酯(ART)对多种肿瘤都具有抑制且逆转耐药的特性。本项目在前期用ART成功抑制ACC细胞体内外生长的基础上，进一步检测ART处理对经顺铂诱导获得的ACC多药耐药细胞系的生物学效应。通过细胞学及裸鼠原位移植瘤及肺转移瘤模型等体内外实验观察ART对耐药癌细胞的形态、结构、增殖、凋亡、克隆形成、血管生成抑制、抑癌效果、侵袭转移等指标和特性的影响。免疫组化、RT-PCR、Western Blot检测与顺铂及ART相关的耐药相关表型标志物的表达。采用全基因组芯片与蛋白质谱在ART治疗后耐药细胞与亲代细胞中筛选差异表达的基因和蛋白，通过Gene Ontology分类和Tree View分析等生物信息学方法初步确定ACC多药耐药相关基因表达谱和ART药物作用的靶位点，选几个有代表意义的基因利用RT-PCR和Western blot验证。

肿瘤多药耐药的分子机制异常复杂，在传统化疗药之外寻找开发新的对肿瘤细胞具有抑制效果或耐药逆转效应的药物成为必要。本研究以腺样囊性癌等癌种为亲本细胞系通过体外诱导的方法建立顺铂（DDP）耐药的细胞系，经检测鉴定其获得多药耐药特性后，以青蒿琥酯(ART)作用于耐药细胞系，MTT法、流式细胞术、Transwell侵袭迁移实验检测其对耐药细胞生长、耐药性、增殖、侵袭及血管生成的影响，qRT-PCR、Western blot法检测各因子的mRNA及其蛋白的表达，从而探讨ART对耐药细胞生物学特性的影响及机制。构建耐药细胞系裸鼠腮腺原位动物模型及靶向抑制 CXCR4的耐药腺样囊性癌细胞系移植瘤模型，观察瘤组织生长、成瘤能力及远处转移情况，免疫组化、qRT-PCR、Western Blot法检测各组瘤组织生存、血管生成、耐药等相关标志物的表达，探讨ART对腺样囊性癌耐药细胞裸鼠移植瘤是否具有抑制作用，是否可以增高耐药细胞的顺铂敏感性。转录组测序对移植瘤组织中人源癌细胞进行分析，与非用药对照组数据作比较，筛选出移植瘤中的差异表达基因。结果示：本小组成功建立耐药指数为2.16的耐药细胞系并利用该细胞系成功建立裸鼠腮腺癌移植瘤动物模型。体内外研究发现ART在体内外可通过下调耐药细胞及裸鼠移植瘤组织中耐药基因C-myc癌基因、乳腺癌耐药蛋白2（ABCG2）、生存素（survivin）、多药耐药相关蛋白2（MRP2）、核苷酸切除修复交叉互补基因1（ERCC1）的表达逆转耐药细胞系的某些耐药特性。同时，ART可在体内外抑制耐药细胞系的侵袭迁移并抑制肿瘤细胞诱导的血管新生。其作用机制可能与金属机制蛋白酶9（MMP-9）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、环氧化物水解酶2（COX-2）表达下调，E型钙黏蛋白（E-cadherin）表达上调有关。本研究通过转录组测序分析不同用药组裸鼠移植瘤组织中的肿瘤细胞，筛选出差异基因，所涉及大量基因和多个通路中核糖体信号通路与氧化磷酸化信号通路可能与肿瘤细胞增殖与耐药相关，刺参核糖体蛋白L17基因(RPL17)、辅酶Q-细胞色素C还原酶结合蛋白B1(UQCRBP1)、呼吸链相关基因 Cox7a2、NADH氧化还原酶辅酶6(NDUFA6)等可能发挥作用，其作用机制尚需进一步验证分析和研究。