基于Neddylation抑制肿瘤相关巨噬细胞M2型极化的ATRA抗骨肉瘤转移作用机制研究

High rate of metastasis is a characteristic of osteosarcoma, which limited patient survival. Though the anti-metastasis strategy by inhibition of tumor-associated macrophages (TAM) M2 type polarization has gained wide attention, its relation with osteosarcoma metastasis remains elusive. Our study found that all-trans retinoic acid (ATRA) could specifically inhibit TAM M2 type polarization, and display significant anti-metastasis efficacy in osteosarcoma, which is accompanied by an increased level of intracellular neddylation. We wish to further clarify the relation between M2 type polarization with osteosarcoma metastasis, reveal the possible mechanisms underlying the anti-metastasis potential of ATRA by inhibition of M2 type polarization, explain how ATRA-activated neddylation suppressed M2 type polarization, and find the downstream targets of RARα after its neddylation. Our study not only will clarify how ATRA regulates M2 type polarization during osteosarcoma metastasis, but also test the feasibility of anti-metastasis treatment via M2 type polarization intervention, thus providing the potential target and theoretical basis for the design and discovery of novel anti-tumor drugs.

骨肉瘤的高转移特性是当前限制患者生存率进一步提高的关键因素，抑制肿瘤相关巨噬细胞（TAM）M2型极化的抗转移策略受到广泛关注，但在骨肉瘤中相关研究尚处于起步阶段。我们前期发现，全反式维甲酸（ATRA）可特异性地抑制TAM M2型极化，并发挥极为显著的抗骨肉瘤转移作用，同时伴随着细胞内neddylation修饰水平的提高。基于此，本课题将进一步明确M2型极化与骨肉瘤转移的相关性；研究ATRA通过抑制M2型极化发挥抗骨肉瘤转移作用的可能机制；探索ATRA激活neddylation的分子机制及其在抑制M2型极化中的作用，及对RARα及其下游靶基因的分子调控机制。通过本课题的研究，不仅将阐明ATRA调控M2型极化从而发挥抗骨肉瘤转移作用的新分子机制，探索通过干预M2型极化治疗肿瘤转移的可行性，并为设计和发现基于M2型极化调控的全新抗肿瘤转移药物提供潜在靶点和理论依据。

骨肉瘤的高转移特性是当前限制患者生存率进一步提高的关键因素，据报道，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）M2型极化在癌症的侵袭和转移过程中发挥了重要的作用。前期研究发现，全反式维甲酸（ATRA）可特异性地抑制TAM M2型极化，并发挥极为显著的抗肿瘤转移作用。基于此，本课题围绕ATRA、TAM M2极化、骨肉瘤转移开展研究，从分子水平上探索ATRA抑制骨肉瘤转移过程中对TAM M2型极化的调控作用及其作用机理。首先，在骨肉瘤体内转移模型中共接种巨噬细胞可显著增加肺转移灶点中表达F4/80+CD206+的M2型巨噬细胞的比例，而对M1型巨噬细胞无明显作用，明确了巨噬细胞M2型极化可促进骨肉瘤肺转移；其次，在传代巨噬细胞系RAW264.7和体外诱导的小鼠原代巨噬细胞BMDM两个层面，采用流式细胞术、qRT-PCR和ELISA证实了ATRA可选择性抑制巨噬细胞的M2型极化；利用体外划痕修复实验和Transwell迁移实验以及体内尾静脉接种和原位接种小鼠模型，证明了ATRA可显著抑制体内外巨噬细胞的M2型极化，继而抑制肿瘤细胞的体外运动迁移或体内转移。此外，研究发现ATRA在抑制巨噬细胞M2型极化时不仅提高了细胞内类泛素化修饰neddylation的总体水平，而且显著上调了RARα蛋白的neddylation化。由此推测RARα可能是细胞内neddylation修饰又一重要的底物蛋白，neddylation修饰调控RARα的蛋白稳定性，促进其降解，从而最终发挥抑制肿瘤的发生发展（如典型的骨肉瘤转移）的作用。通过本研究的开展，确证了将巨噬细胞作为抗肿瘤转移治疗新靶点的潜在价值，并为设计基于抑制M2型极化的全新抗肿瘤转移药物或干预手段提供思路及潜在靶点。