植物特异驱动蛋白KCBP介导微管与微丝相互作用机制的研究

Plant cytoskeleton, including microtubules and actin filaments,cooperates to regulate cell morphogenesis. However, mechanisms underlying the crosstalk between microtubules and actin filaments remain largely unknown. Arabidopsis trichome provides an ideal model for the regulation of cytoskeleton in polarized cell elongation. The kcbp mutant shows defects in trichome branching and elongation, suggesting that KCBP interplays between microtubules and actin filaments, yet little is known about the mechanism. In this study, we will firstly verify the abnormal organization of both microtubules and actin filament during trichome development in kcbp mutant. Live cell imaging will be performed to investigate the localization of KCBP at microtubules and actin filaments, and its dynamic parameters. Secondly, individual domains of KCBP including the unique MyTH4-FERM domain will be expressed and purified, and in vitro binding assay will be conducted to elucidate its/their microtubule or actin-binding ability. Finally, we will make constructs with the truncation of the individual domains, and introduce the constructs into the kcbp mutant to verify in vivo function at the genetic level. The predicted outcome will reveal the mechanism how the plant unique kinesin, KCBP, orchestrates the interplay between microtubules and actin filaments, and greatly facilitates the understanding of cooperative regulation between microtubules and actin filaments during polarized cell elongation.

植物细胞骨架组分—微管和微丝协同调控植物细胞形态建成，但对两者之间的分子对话机制的认识仍十分肤浅。拟南芥表皮毛是研究细胞骨架调控细胞极性生长的理想模型。KCBP基因突变后影响表皮毛分支的起始及伸长，提示它同时调控微管与微丝的组织，但具体机制尚不清楚。本课题首先将证实kcbp突变体表皮毛发育过程中周质微管和微丝的动态组织异常。利用活细胞成像技术观察KCBP在周质微管和微丝上的定位及动态特性。将分不同组合、分段表达KCBP特有的结构域，特别是N端的MyTH4-FERM结构域，进行体外的微管、微丝结合及动态特性分析，解析其对微管和微丝动态作用方式。构建不同结构域缺失的表达载体去互补kcbp突变体的表型，在遗传学水平证实其功能。预期结果将揭示KCBP这个植物特有的驱动蛋白如何作为微管和微丝间的动态联结子，调控表皮毛分支的起始与延伸，将促进人们对微管和微丝协同调控细胞极性生长机制的理解。

植物细胞骨架（微管和微丝）在细胞形态建成过程中发挥着核心作用，研究发现微管和微丝之间存在着复杂而有趣的分子对话。但是，当前对它们之间相互作用机制的认识还十分肤浅。KCBP 是一个植物特有的、独一无二的驱动蛋白，其突变体 kcbp的表皮毛发育缺陷表型提示微管和微丝的动态组织均出现异常，但是具体机制的研究一直没有取得突破。. 本课题首先在活细胞水平下观察到KCBP与拟南芥周质微管共定位，并沿着微管运动；有趣的是，我们发现快速伸长的表皮毛分支中GFP-KCBP不仅与横向密集排列的“周质微管环”阵列共定位，还在表皮毛细胞顶端的“微管缺失区域”特异富集，此区域周质微丝形成“微丝帽子”结构；同时，我们体外纯化了KCBP 特有的结构域的6个不同组合，在体外结合试验证明了KCBP独有的 N-端 MyTH4 结构域可以结合微管，FERM 结构域则可以结合微丝；构建不同结构域缺失的表达载体去互补 kcbp 突变体的表型，并结合rigor-KCBP突变体的表皮毛表型，在遗传学水平证实特有结构域NT-MyTH4是KCBP功能必需的，KCBP具有调控微丝动态变化的功能；上述研究结果证明了 KCBP通过介导微管和微丝的相互作用，调控表皮毛的形态建成。 . 为了探究KCBP介导“微管缺失区域”的形成可能与微管切割相关，我们对微管切割蛋白复合体katanin调控表皮毛发育过程中微管动态组织机制进行了研究。当发生微管切割作用时拟南芥中katanin p80起着精确制导作用。我们用显性负调控的方法进行遗传学分析，发现KTN80.2的N端或C端的过表达都会使拟南芥表皮毛发育发生异常，这预示着katanin复合体在表皮毛发育过程中调控微管动态组织。下一步我们将深入研究，拟南芥表皮毛细胞发育中“微管缺失区域”的形成过程中KCBP和微管切割蛋白复合体katanin的作用机制。同时，我们优化构建了一系列适用于活细胞成像的微管标签载体及微管标签株系，为微管领域的研究增加了优质的荧光标签备选。