亚麻木质素合成关键酶基因的功能和调控机制研究

高木质素含量是影响亚麻纤维产量和品质的重要因素。木质素代谢途径复杂，已有研究表明几个关键酶的编码基因均为多基因家族。亚麻木质素合成关键酶基因功能鉴定和调控分析是培育低木质素含量亚麻新材料的重要基础。本项目组成员在前期已通过同源扩增获得8个亚麻木质素合成关键酶基因同源片段和1个全长cDNA序列，并进行了不同部位和发育时期各基因表达特征分析。本项目将在此基础上利用RACE扩增的方法获得亚麻木质素合成基因的全长序列并构建RNAi表达载体，建立适合南方种植的亚麻品种高效的亚麻遗传转化体系，通过对亚麻木质素合成关键酶基因RNAi转基因材料的木质素和纤维素含量等成分分析、抗逆能力和抗倒伏能力鉴定，确定木质素代谢过程中不同基因的功能和表达调控特征，并筛选获得低木质素的亚麻转基因新种质材料；为低木质素亚麻分子育种奠定基础。

亚麻是我国重要的经济作物，其纤维是重要的纺织原料。在纺织工业中，木质素是脱胶工艺和纺织品质量的制约因子，且去除木质素过程中的废水造成严重的环境污染。因此，利用基因工程手段降低木质素含量或改变其组分，从原料上解决造纸及纺织业的污染问题，已成为国内外研究的热点之一。本研究克隆了亚麻木质素合成关键酶基因COMT和4CL的全长序列，并利用生物信息学对其进行分析；利用构建的亚麻COMT基因的RNA干扰载体，进行了农杆菌介导的亚麻下胚轴遗传转化研究，取得的主要结果如下：（1）采用RACE法分别获得COMT和4CL基因cDNA全长序列，并提交GenBank，获得登录号分别为KC832864和KC832865。COMT的cDNA全长序列为1726bp，含有1104bp完整的开放阅读框，在GenBank中赤桉、银合欢等的COMT序列具有较高的同源性。4CL的cDNA全长序列为1957bp，含有1650bp完整的开放阅读框。与欧洲花楸、盐芥的4CL序列具有较高的同源性。（2）通过PCR扩增出CCOAOMT、4CL、COMT用于RNAi的顺反式片段。并通过中间载体pB3D-Linker连接最后连入表达载体peAMBIA130lM中,构建了RNAi植物表达载体pCCoAOMT-RNAi、4CL-RNAi和pCOMT-RNAi。（3）利用木质素合成关键酶基因4CL、COMT的RNA干扰载体，通过农杆菌介导法转化亚麻下胚轴，优化了亚麻品种派克斯的遗传转化体系。优化后的亚麻遗传转化体系为：使用MS1培养基作为遗传转化的基本培养基；取对数生长期的菌液在含AS的YEP培养基(不含抗生素)中活化6h；下胚轴预培养3d，在OD600值为0.5~0.8的菌液中侵染30min；共培养基中添加AS；共培养4d，共培养温度20℃；延迟6d进行选择培养；脱菌抗生素选用氨苄青霉素，使用浓度300mg/L；选择标记抗生素为潮霉素，愈伤形成及分化时使用浓度为25mg/L，生根时使用浓度为9mg/L；筛选培养基中添加5mg/L的AgNO3可以明显降低下胚轴的褐化率。（4）再生苗的检测对获得的再生苗进行了GUS检测和PCR检测。通过GUS染色再生苗的叶片呈现蓝色，PCR扩增出目的条带，说明4CL、COMT基因已整合到亚麻基因组中，并且产生一定的干扰效果。（5）培养硕士研究生2人，发表论文5篇，其中SCI收录1篇。