Ghrelin促进人类胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的作用及其机制

本课题组在预实验中初步证实，胃肠道激素ghrelin可呈剂量依赖性促进人类胚胎干细胞（hES细胞）体外诱导定向分化为自发搏动的心肌细胞团，并且初步探索了可能起作用的信号转导通路。本项目的研究内容包括：⑴ 对预实验中已建立的体外诱导hES细胞分化为心肌细胞的传统方案进行改良，通过筛选中胚层前体细胞后再进行体外诱导定向分化，以明确ghrelin对hES细胞分化为心肌细胞的促进作用，并探索建立高效的体外诱导分化方案的可行性。⑵ 确定hES细胞和不同诱导分化阶段细胞中ghrelin受体的特征，明确ghrelin促进hES细胞定向分化为心肌细胞的信号转导机制。⑶ 明确过表达ghrelin在心肌梗死小鼠模型体内对hES细胞来源的前体细胞定向分化为心肌细胞的作用，以验证体外实验的结果。本课题的完成将有助于阐明ghrelin促进hES细胞分化为心肌细胞的作用机制，为干细胞治疗心肌梗死的应用研究奠定基础。

胃肠道激素ghrelin是生长激素促分泌物受体（GHS-R）的内源性配体。业已证实，ghrelin不仅具有心血管保护效应，而且可调节肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞等中胚层细胞的分化。但ghrelin在心脏发生过程中的作用及其分子机制尚未阐明。在本课题中，我们采用基于拟胚体（EB）途径的人胚胎干（hES）细胞体外诱导分化研究和将hES细胞移植到大鼠心脏的体内实验，探讨ghrelin对心肌细胞分化的影响，并且探讨ghrelin作用的分子机制。结果显示，ghrelin可增加搏动EB的比例和心肌特异性标志物如心肌肌钙蛋白I（cTnI）和α-肌球蛋白重链（α-MHC）的表达，并且该促进效应呈剂量和时间依赖性。虽然在分化EB中可检测到GHS-R1α的表达，但是添加GHS-R1α拮抗剂D-[lys3]-GHRP-6并不能阻断ghrelin促进心肌分化的作用。此外，非酰基化ghrelin虽然不能与GHS-R1α结合，但却具有与ghrelin相似的促分化效应。在新形成的EB中，ghrelin可激活ERK1/2，但不能激活Akt（PI3K的下游分子）。与此同时，ghrelin或非酰基化ghrelin的促心肌细胞分化效应可通过添加特异性ERK1/2抑制剂PD98059而被完全消除，但却不受特异性PI3K抑制剂wortmannin的影响。提示ghrelin促进hES细胞向心肌细胞分化是通过激活ERK1/2而非PI3K/Akt信号通路而发挥作用。不论在心肌梗死大鼠或正常大鼠的心脏中，ghrelin治疗均可促进移植的hES细胞分化为Sox9和Flk1阳性的中胚层/心肌前体细胞，但未能显著改善心肌梗死后大鼠的心功能减退。本研究在国内外首次阐明了ghrelin可促进hES细胞向心肌细胞分化及其作用机制，ghrelin通过激活ERK1/2信号通路而促进hES细胞分化为心肌细胞。因此，应用ghrelin不仅在体外诱导干细胞向心肌细胞分化中可作为提高分化效率的一种有效策略，而且在细胞替代治疗和促进心肌再生中可能具有重要价值。本项目已发表论著10篇，其中SCI 6篇，中文核心4篇；在国内核心期刊发表述评、综述等7篇。研究成果在全国性大型学术会议上做大会报告3次、专题报告6次或口头发言10余次，并且在2012年美国糖尿病学会年会（ADA）上进行交流。培养研究生8名，其中博士5名，硕士3名。