清热解毒通络法对急性脑梗死热毒证脑微血管内皮细胞炎性信号通路的调节机制

脑梗死急性发病3-5天时出现的热毒证是病情加重、恶化乃至死亡的重要标志。热毒损伤脑络、败坏脑髓是其病机关键。本课题拟证实激活脑微血管内皮细胞上TLR4信号通路，启动并放大瀑布式炎性反应是急性脑梗死"毒损脑络"重要的生物学基础；"清热解毒通络法"可以通过调整该信号通路减轻炎性反应，成为该法对脑微血管内皮细胞甚至脑神经血管单元起保护作用的重要机制之一。本课题在中医病证结合理论的指导下，建立急性脑梗死热毒证大鼠模型和人脑微血管内皮细胞缺血再灌注模型，以"清热解毒通络法"代表药苦碟子注射液干预，观察炎性因子对脑微血管内皮细胞TLR4表达的时间、空间分布规律；研究对炎性因子、TLR4及其信号通路下游分子激活情况的影响。从组织、细胞、分子三个不同层面研究急性脑梗死热毒证与脑微血管内皮细胞上TLR4信号通路激活、炎性因子表达的相关性，明确"清热解毒通络法"对TLR4信号通路的作用靶点和调节整合效应机制。

本课题采用角叉菜胶复合线栓法MCAO建立缺血性脑卒中热毒证大鼠模型，大鼠出现舌色发暗、舌下络脉增粗增长、耳廓边缘发红、爪甲肿胀红紫，尾部颜色暗红等瘀热表征，体温有大幅度升高，接近于中医的热毒征象；全血黏度增高的同时血液处于低凝状态，以上说明热毒证+MCAO复合模型成立。整体实验：随着急性脑缺血再灌注6h开始，热毒证复合MCAO大鼠血液处于持续的低凝状态，神经细胞形态出现损伤，TLR4蛋白和基因表达升高，于再灌注 72h逐步下降，苦碟子注射液明显改善神经细胞形态，改善凝血系统，降低热毒证复合MCAO大鼠再灌注6h和24h的Myd88蛋白，TLR4蛋白和基因表达。细胞实验：培养大鼠脑微血管内皮细胞，缺氧6h复氧3h造成细胞损伤，4%苦碟子注射液能够增加细胞活性，下调TLR4、TRAF6、NF-kB、TRIF、IRF-3蛋白表达，对Myd88、TBK-1蛋白表达无作用，降低TNF-α、IL-1β。提示苦碟子注射液治疗急性脑梗死热毒证的作用机制可能与调节脑组织与大鼠脑微血管内皮细胞的TLR4-TRAF6-NF-kB和TRIF-IRF-3-NF-kB信号转导通路，调节炎症因子含量，降低脑梗死面积有关。本课题从组织、细胞、分子三个不同层面研究急性脑梗死热毒证与脑微血管内皮细胞上TLR4信号通路激活、炎性因子表达的相关性，明确“清热解毒通络法”对TLR4信号通路的作用靶点和调节整合效应机制。