结核分枝杆菌聚磷酸盐外切酶Rv1026调控分枝杆菌生物膜形成的分子机理的深入研究

This proposal aims to elucidate the molecular mechanisms underlying the role of Mycobacterium tuberculosis exopolyphosphatase Rv1026 in the mycobacterial biofilm development, the special emphasis is the underlying target and network, signal molecules involved. The highlighted sections are: (1) construction of the mutants deleted the Rv1026, mutants overexpressed Rv1026; (2) The transcriptome and quantitative proteome dynamics, morphology and structural difference, together with putative signal molecule concentration variation will be depicted and followed; (3) The putative pathway involved in this regulation will be portrayed and crucial nodes will be selected for further validation;(4) quantitative-PCR or small compound entity targetting interested gene or its product will be harnessed to validate their effect upon mycobacterial biofilm formation; (5) a model representing above findings will be formulated. The answer to above scientific questions will shed new lights on the regulation of mycobacterial biofilm and other bacterial biofilm, serving as a basis to discover more targets, especially biofilm related ones, to tackle the drug resistant or persistent bacterial infection.

本研究是我们前期首次发现并报道的结核分枝杆菌聚磷酸盐外切酶Rv1026影响分枝杆菌生物膜工作的继续。旨在探索Rv1026调控生物膜形成涉及的靶标以及信号分子等两个关键科学问题。主要研究内容包括：（1）构建分枝杆菌突变菌株；（2）差异发现-研究突变菌株和野生型在生物膜形成过程中，转录组、蛋白质组和代谢物组的差异，生物膜形态和结构差异；（3） 整合转录组、蛋白质组和代谢物组的数据，预测Rv1026调控生物膜形成的可能途径和后续实验验证的重点，（4）三个水平的验证：qPCR在基因转录水平验证，定点突变菌株构建和回补在遗传水平、添加部分化合物在功能水平验证对生物膜形成的影响；（5）建立分子机理模型。上述研究结果可能首先揭示分枝杆菌生物膜形成的调控分子新机理，丰富细菌生物膜形成的分子机理认识，为研发防控生物膜参与的耐药和持留菌措施提供基础。

按照项目任务书，完成了指标。.结核菌导致的结核病仍然是全球严重的公共卫生威胁。深入研究结核菌独特生理背后的遗传基础有助于研发更好的结核病控制措施。结核菌的生物膜问题是一个被圈内广泛忽略，但是又被几个资深研究这如william Jacob，Ian Orme等反复呼吁应当重视的方面。多聚磷酸盐（polyphosphate，polyP）是由几个到几百个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合而成的线性多聚体。PolyP 在生理过程中发挥了重要的作用，如作为能源和磷源库、金属离子螯合剂和缓冲剂，以及应对环境胁迫、调节基因表达等。很多酶参与了polyP代谢过程。外切聚磷酸酶（exopolyphosphatase，PPX）能持续水解并释放polyP末端磷酸基。我们课题组在世界上率先报道证实了结核分枝杆菌的外切聚磷酸酶（exopolyphosphatase，PPX）（Rv1026）具有功能，并且影响生物膜形成。在本研究中，我们研究PPX影响生物膜形成的机理。 一年中，主要开展了5个方面的工作,发现外切聚磷酸酶影响乙酰化酶表达，并进而影响氨基酸和脂肪酸代谢。.1.成功构建了外切聚磷酸酶（Rv1026）表达重组菌MS_PMV-261-Rv1026和空载对照重组菌（MS_PMV-261）。.2.RNA-Seq比较了两种重组菌和野生型对照在4个生长时间点（0h,24h,48h,72h）的转录组以及表达的小RNA谱。利用和计算机同事研发的独特的途径富集分析的生物信息学软件，对在不同时间点差异表达显著的基因进行了分析，富集了170个途径特异性差异表达的基因，约12个途径。.3.挑选部分途径及其关键基因进行了RT-PCR验证，并从代谢途径的下游效应进行了分析。其中之一是可能调控精氨酸合成的乙酰基转移酶的表达发生改变。过表达型菌株体内MSMEG_3513、MSMEG_2691这2个基因的转录水平均存在明显差异，其中过表达菌株的MSMEG_3513基因转录水平下调了12倍左右，MSMEG_2691的基因转录水平下调了2倍。.4.这在同时进行氨基酸合成变化中也得到验证。在MS_PMV-261细胞液中Arg和His的相对含量较MS_PMV-261- Rv1026菌株细胞液中的相对含量大。.5.与转录组数据中去饱和酶的表达变化一致，重组菌相应的脂肪酸含量也呈现特殊的变化规律。24h时，MS_PMV-261-Rv