Sema3A对视网膜神经节细胞极性的影响在视神经损伤修复中的作用和机制研究

Nerve regeneration is limited after optic nerve injury ,that make the irreversible damage of visual function. Despite the strategy of promoting the growth of optic nerve may have some protective effect , but optic dysfunction is still unsolved due to the disorder of neuronal polarity.Sema3A is closely related to the establishment and maintenance of neuronal polarity, but how it involved in the polarity disorder of RGC in the optic nerve injury is unclear. This project intends to research this issue in the level of animals and cells. we will first confirm that the polarity disorder of RGC play a important role in the optic nerve regeneration fail,and Sema3A promotes to the polarity disorder of RGC in the damage of the optic nerve. Then we will verify that the molecular mechanism may be closely connected with the changes in PKA-dependent phosphorylation of GSK3BETA,a proteins critical for axon formation；and finally by decreasing micro30b inhibit the expression of Sema3A in the damage of the optic nerve, promote polarity of RGC stable and recovery of visual function.

视神经损伤后再生能力有限，给患者带来不可逆的视觉损害。尽管通过促进视神经生长起到一定刺激神经生长的作用，但神经元极性紊乱导致视功能无法完全恢复。Sema3A与神经元极性建立和维持密切相关，其在视神经损伤修复中参与调节RGC极性紊乱及重要机制尚不清楚。本项目拟在动物和细胞两个层面，首先证实RGC极性紊乱是影响视神经修复的重要原因，且Sema3A在视神经损伤过程中促进RGC极性紊乱。其次验证其分子机制可能与改变PKA依赖的GSK3β磷酸化有关；最后通过观察micro30b抑制Sema3A在视神经修复中的表达，促进RGC极性稳定，帮助视功能恢复的效果，一方面证实上述假设的正确性，另一方为视神经损伤后修复的研究提供全新的观点和方法。

背景：成熟神经元内在再生能力的减弱和受损轴突周围微环境的变化被认为是再生失败的主要原因。了解轴突再生障碍和机制是探索新疗法和促进视力的关键。信号素3A（Semaphorin3A）是信号素家族的重要成员。Sema3A不仅仅是抑制轴突再生的轴突负导向因子，也参与各种免疫反应，调节机体炎症反应。星形胶质细胞和小胶质细胞是视网膜炎症反应的重要因素，我们的研究旨在研究视神经损伤后Sema3A对于星形胶质细胞和小胶质细胞的激活作用，并观察其对视网膜RGCs的存活的影响。.方法：本研究中使用小鼠视神经损伤模型和原代星形胶质和小胶质细胞与原代RGCs体外共培养模型。我们使用WB和免疫荧光染色的方法检测Sema3A、C3、Iba1等蛋白的表达。并通过RT-qPCR和流式细胞技术观察A1/A2星形胶质细胞和M1/M2小胶质细胞的表型转换。最后利用全视网膜铺片及Tunel染色观察RGCs凋亡的情况及WB分析凋亡相关蛋白。.结果：我们发现在体外实验中发现星形胶质细胞C3表达增加，同时RGCs凋亡增多，说明A1表型星形胶质增加。在小鼠视神经损伤模型中证明损伤后Sema3A水平升高同时小胶质细胞激活，并向M1表型转换。再利用体内和体外试验分别验证Sema3A导致小胶质细胞M1/M2表型转换的关键上游蛋白。.结论：结果证明Sema3A 通过调节细胞内PKA 依赖性GSK3β 活性，达到影响RGC极性效应；视神经损伤后，Sema3A可以抑制轴突再生，Y-27632可以缓解该抑制作用；Sema3A可促进ROCK2下游轴突生长效应分子MLC2磷酸化。视神经损伤后A1型星形胶质细胞显著增加，造成RGCs继发性损伤。而Sema3A升高也伴随小胶质细胞激活，并且Sema3A是诱导小胶质细胞逐渐向M1表型转换的关键蛋白，造成RGCs凋亡。这可能为视神经损伤的病理过程提供新的理论依据，为其治疗提供新的非侵袭性的治疗方法。