中华绒螯蟹精子发生过程中核碱性蛋白转移与非浓缩精子核表观特征

The sperm nucleear basic proteins(SNBPs) combined with DNA have an important effect on the sperm nuclear structure, DNA protection, fertilization, and so on. Different from most of animals' condensed sperm nucleus, the sperm nucleus of Eriocheir sinensis is noncondensed. Studies showed that there was a transfer of nucleus basic proteins (NBPs) during the spermatogenesis of E. sinensis, and some acetylated basic proteins still remained in the sperm nucleus. But it is not clarified which basic proteins transfered and which proteins remained and were modified. In this project we will use Two-dimensional electrophoresis, high performance liquid chromatography-massspectrometry (HPLC-MS) and reversed-phase high-performance liquid chromatography to separate, indentify and purify the NBPs of spermatogonium, spermatocyte and sperm as well as basic proteins released by the soerm acrosome reaction in E.sinensis; then we will prepare antibody of the basic proteins purified, and immunolocalize the distribution of basic proteins; and we will use antibody of histones with acetylation and methylation to analyze the modification characteristics of NBPs; at the same time, we will measure the amino acid constitution of the basic proteins purified by means of amino acid sequence analysis. The results will show transfered characteristics of basic histone during the spermatogenesis of E. sinensis, whether new basic proteins will be synthesized, the type and modification of the NBPs, the constitution of amino acid, and the combine style among SNBPs, and that of SNBPs and DNA, and so on. The results can also provide basic foundation to clarify the protection mechanism of sperm DNA , the evolution position of sperm and the sperm quality evaluation, which will have important theory and practical significance.

动物精子核DNA结合的碱性蛋白对精子核结构、DNA保护、受精等方面有重要的作用。与多数动物浓缩的精子核不同，中华绒螯蟹精子为非浓缩核。研究发现中华绒螯蟹精子发生过程中核碱性蛋白发生了转移，精子核中仍含碱性蛋白且有乙酰化修饰。但何种碱性蛋白发生了转移?精子核中留有何种蛋白及其修饰尚未阐明。本项目利用双向电泳、液质联用、高效液相色谱等技术分离、鉴定和纯化精原和精母细胞核、精子核和顶体反应释放的碱性蛋白；制备抗体，免疫跟踪不同碱性蛋白的分布特征；利用乙酰化和甲基化组蛋白的抗体分析精子核碱性蛋白修饰特征；通过氨基酸序列分析，测定其氨基酸的组成。研究结果可以探明中华绒螯蟹精子发生过程中碱性蛋白的转移特征，有无新碱性蛋白合成，精子核碱性蛋白种类、修饰及氨基酸组成，精子核碱性蛋白之间及其和DNA的结合方式等。同样为阐明其精子DNA保护机制，精子演化地位，精子质量评价等提供依据，具有重要的理论和实践意义。

中华绒螯蟹(简称河蟹)隶属十足目甲壳动物，是我国重要的水产经济动物。与多数动物不同，其精子具有非浓缩核和不运动特征，也是诸多学者兴趣所在。项目利用细胞、分子、生化等技术，克隆了组蛋白H2A、H2B、H3、H4、H1及H3、H1变体基因的cDNA序列，构建了核心组蛋白基因原核载体，表达、纯化了4种核心组蛋白，结合蛋白免疫定位技术系统研究了组蛋白H2A、H2B、H3、H4、H1及H2A、H3和H1变体及修饰的组蛋白在河蟹精子发生过程中的表达和分布特征。结果如下：(1) 克隆了4种核心组蛋白基因cDNA序列，分析其表达的蛋白与其它动物的存在相关性与保守性，如河蟹的组蛋白H3 的氨基酸序列与非洲爪蟾的完全相同，与人、小鼠和斑马鱼的仅有1个氨基酸的不同。(2) 4种核心组蛋白H3、H4、H2A、H2B 存在于河蟹各期生殖细胞的细胞核中。(3) 荧光定量PCR 分析显示组蛋白H1及其变体在各期生殖细胞中表达，且二者表达量均在精子期最低。(4) H3.3组蛋白变体存在于各期生殖细胞的细胞核，且存在于精子核的特定位点。 (5) 精原细胞和精母细胞的细胞核存在泛素化的组蛋白H2A(H2A119 ub)，成熟精子中泛素化H2A则出现在精子核和顶体中；磷酸化的H2A和H4(HS1 ph) 分布于精母细胞、精细胞的细胞核和细胞质，成熟精子中则分布在顶体囊；各期生殖细胞细胞核存在乙酰化修饰的H4；乙酰化H3(H3K9 ac)存在于精原细胞和精母细胞的细胞核，在精细胞后期向细胞核外转移。 (6) 组蛋白H2AX和γ-H2AX在精母细胞和精细胞的细胞核及细胞质中均匀分布；成熟精子分布在细胞核和顶体管。总之，在河蟹成熟精子非浓缩的精子核中，核心组蛋白保留，且有组蛋白变体存在，同时核心组蛋白也呈现一定程度和形式的修饰，可能与其核非浓缩状态相关。. 研究结果首次阐明了河蟹精子核核心组蛋白组成和部分组蛋白修饰特征，为探明其精子非浓缩核形成机制提供了科学依据；发现部分修饰组蛋白转移到顶体，为弄清其顶体生物发生及受精机制提供了新的资料；同时，精子表观遗传研究为河蟹种质保护与改良的应用提供借鉴。研究成果具有重要的理论价值和实践意义。