快速单细胞胆固醇电分析平台的建立及其在斯达汀类药物开发中的应用

心血管疾病是威胁人类健康的最常见疾病，其发病率在中国居于首位。细胞中的胆固醇淤积是产生血脂异常，进而动脉粥样硬化和心血管疾病的重要原因。目前治疗心血管疾病的药物研究主要集中在改进斯达汀药物结构，从而更为有效的降低细胞中胆固醇含量。本项目利用胆固醇氧化酶可和细胞中的胆固醇发生反应，产生具有电化学活性的双氧水的现象，建立了一种在线无干扰测定单细胞中胆固醇含量的电化学平台。这种单细胞研究方法能够更为详尽的研究药物处理后细胞内胆固醇含量的分布信息。结合微孔洞设计，该单细胞分析平台速度可由通常的48 个细胞/8 h提高到2880个细胞/8 h，满足药物开发中分析细胞数量的要求。在该快速分析平台建立的基础上，一系列斯达汀改进物将被逐一测试并筛选。该平台的成功建立可以为以后的大规模药物筛选提供技术和信息支持。

在青年基金的支持下，本项目按照计划完成既定目标，取得了一系列的成果，以通讯作者发表Anal Chem 4篇，申请3项专利。研究成果包括：一是发展了一种基于电致化学发光技术的新型单细胞胆固醇分析新方法。我们通过引入胆固醇氧化酶，与细胞膜表面的活化胆固醇发生反应，产生双氧水；利用电极界面双氧水和鲁米诺产生的电致化学发光信号，对单个细胞表面的活化胆固醇实现检测；研究结果表明，同种细胞表面的活化胆固醇含量具有较大的差异性；鉴于活化胆固醇是控制细胞胆固醇流动的主导因素，因此这种差异性的发现，体现了单细胞胆固醇分析的重要性；该方法在检测过程中突破了传统荧光分析方法需要对细胞进行固定和标记的缺点，实现了原位、无标记和准确的单细胞检测。二是利用微洞电极阵列，发展了一种快速检测单细胞表面活化胆固醇的方法，该工作是第一个工作的延续。第一个工作的缺点在于分析通量低。为此，我们构建了微洞电极阵列，并将单个细胞逐一固定在微洞电极中，通过对微洞电极依次施加电压，进而对单细胞进行快速序列分析；分析速度达到1 cell/3 s,超过了项目设计速度（1 cell/10 s）；通过对64个细胞的逐一分析，发现这些细胞在胆固醇含量上分成两类，75%的细胞具有类似的胆固醇含量，而25%的细胞具有较大偏差的胆固醇，是产生细胞胆固醇差异性的原因。利用该平台，研究了斯达汀类药物对细胞表面胆固醇含量的影响，结果表明，该类药物可以有效的降低细胞表面胆固醇，但是没有改变细胞表面胆固醇含量的差异性。综上所述，本研究拓展了电致化学发光技术的应用，成功发展了一种新型的快速单细胞分析方法，克服了电化学分析通量低和荧光方法需要标记的缺点；也有力的锻炼了青年负责人的独立科研能力，达到了预期目的。