microRNA簇C19MC中miR-517c和519a在恶性胶质瘤放化疗抵抗中的生物学作用研究

我们已发现在位于19q13.41的microRNA簇（C19MC）中，miR-517c和520g可抑制原发神经外胚层肿瘤的凋亡，并促进在血清饥饿条件下的细胞存活。进一步检测多种GBM细胞系和肿瘤干细胞，发现该簇中miR-517c和519a存在明显高表达。对60例恶性胶质瘤进行qPCR筛选，在27例（45%）中发现此两种miRs的低表达。结合临床病例的随访结果，更发现其低表达和恶性胶质瘤病人较好的预后相关，这提示其很可能在恶性胶质瘤细胞抗凋亡及放化疗抵抗中存在重要作用。本课题拟构建miR-517c和519a过表达和knockdown的稳定细胞系，通过体外和裸鼠体内试验，明确二者在恶性胶质瘤放化疗抵抗中的生物学作用，并进一步通过蛋白组学的方法筛选二者的靶基因，以Luciferase和Renilla（内参）荧光素酶报告验证，以期为恶性胶质瘤提供分子治疗的靶点，达到放化疗增敏的效果。

恶性胶质瘤（HGG）包括WHO III级和IV级胶质瘤，其中多形性胶质瘤母细胞（GBM）恶性程度最高，虽采用手术联合同步及辅助替莫唑胺（TMZ）放化疗，平均生存时间仅14.7个月，而放化疗抗性被认为是其难治的重要原因。针对上述问题，我们的研究发现在GBM细胞U87（p53野生型）中，低糖、血清饥饿，及替莫唑胺（TMZ）等，能诱导自噬发生，并促进细胞迁移和侵袭，而自噬抑制剂3-MA和氯喹（CQ），及ATG7 siRNA均能逆转上述表型的改变。但在U251细胞（p53突变型）中，没有上述作用。进一步我们发现miRNA簇C19MC中miR-517c和519a能干扰U87细胞的自噬发生，同时细胞迁移和侵袭能力明显下降。而双向蛋白电泳筛选和Luciferase验证，表明miR-517c能抑制KPNA2表达，干扰p53的核内转运，抑制自噬和EMT发生。同时裸鼠体内试验也显示，miR-517c能降低U87细胞对周边组织的侵袭，而透射电镜显示，miR-517c也干扰了自噬的发生。由此我们提出了在不同p53背景下，GBM可能存在不同的放化疗抵抗机制，而miR-517c/KPNA2/p53通路，对p53野生型GBM的TMZ耐药性有重要作用。另一方面，目前已知自噬和凋亡密不可分，其相互转化共同导致细胞的程序性坏死，但在GBM中，二者相互作用机制不明。我们研究还发现C19MC簇中miR-520h可以抑制BCL-2家族的前凋亡蛋白NIX表达，激活NF-κB通路，从而抑制GBM细胞凋亡，促进细胞在缺氧和低营养条件下的存活。同时针对32例临床病例进行了预后分析，结果发现miR-520h高和517c低表达的肿瘤病人，其临床预后更差（总体生存和无进展生存）。上述结果表明，C19MC簇中miR-520h和517c在调节GBM的细胞程序性死亡中，有重要生物学作用，并直接和肿瘤的放化疗抗性相关，而miR-520h/NIX和miR-517c/KPNA2通路值得进一步研究。基于上述结果我们发表了3篇SCI文章，5篇国内核心期刊文章，并培养博士1名（已毕业），硕士1名（已毕业），在读博士2名。