可调控的特定基因甲基化修饰与功能研究细胞模型的建立与应用

Aberrant DNA methylation plays important roles in development of environmental pollutants related diseases. Although it has been demonstrated that environmental chemical exposure can induce aberrant DNA methylation, the functional significance of CpG site-specific DNA methylation (including hypermethylation and demethylation) in regulating gene expression remains unclear due to the limitation of current technical method. In this project, CRISPR/Cas9-based DNA methylation editing method will be applied to establish cell models with engineering DNA methylation of specific genes, including TRIM36, MGMT, p16, and Rassf1A, based on our previous study. Typical environmental carcinogens will be selected to treat the cells at different DNA methylation states and the critical toxic effects such as DNA damage, oxidative stress, apoptosis, and cell transformation will be analyzed. By conducting the in vitro and in vivo studies, we will be able to explore the relationship of DNA methylation and toxic effects, providing direct evidence for the elucidation of causal relationship of DNA methylation, gene expression and cellular function changes. Meanwhile, we attempt to propose a framework and strategy for identification of key region for methylation modification and functional elaboration. In summary, the editable DNA methylation system will be essential for epigenetic mechanism study and for identification of epigenetic biomarkers for environmental health risk assessment.

DNA甲基化修饰变异在环境相关疾病发生发展中起重要作用。虽然现有研究已证明化学物暴露可引起DNA甲基化修饰改变，但多年来由于缺乏关键技术，无法阐明特定区域CpG位点甲基化变异对基因表达调控的影响。本研究拟利用CRISPR/dCas9 DNA甲基化编辑技术针对重要环境应答基因TRIM36、MGMT、p16、Rassf1A建立可调控甲基化修饰细胞模型。用典型环境致癌物处理细胞，通过比较对DNA损伤、氧化应激、细胞转化等关键毒性效应的影响，阐释特定CpG位点甲基化修饰变异的毒理学意义，并结合人群研究进一步验证甲基化调控与毒性效应之间的关联，为“DNA甲基化修饰—基因表达调控—细胞功能改变”因果关系链的建立提供直接证据，并提出甲基化核心修饰区域筛查和功能研究的框架和策略。DNA甲基化编辑细胞模型的建立为阐述环境表观遗传调控机制的理论以及表观遗传生物标志物预测环境化学物暴露风险的应用提供重要技术支撑

DNA甲基化修饰变异在环境相关疾病发生发展中起重要作用，但多年来由于缺乏关键技术，无法阐明特定区域CpG位点甲基化变异对基因表达调控的影响。本项目利用CRISPR/dCas9 DNA甲基化编辑技术针对重要环境应答基因建立可调控甲基化修饰细胞模型，探讨特定区域DNA甲基化在化学物毒性效应中的作用，目前已发表SCI论著4篇，申请了2项国家发明专利，完成了项目的既定目标。主要研究发现有：1.成功建立了基于CRISPR/dCas9的DNA甲基化编辑系统，并对该系统进行了验证。构建了稳定表达CRISPR/dCas9-DMNT3A/TET1CD的A549单克隆细胞株，为研究特定区域DNA甲基化的功能提供有力工具。利用该系统首次揭示了p16基因的CpG岛岸的DNA甲基化对其基因表达有重要调控功能，并发现其关键的DNA甲基化调控区域；2.通过职业人群研究发现多环芳烃（PAHs）暴露与表观遗传修饰包括H3K36me3、H3K79me2，以及TRIM36、RASSF1a和MGMT的特定CpG位点的DNA甲基化密切关联，并且这些修饰之间存在交互作用，提示利用多种表观遗传修饰改变可能可以更好的反映职业性PAHs暴露和毒效应水平。3.发现ACOXL的DNA甲基化编辑在PAHs致癌中的作用及调控机制。ACOXL在PAHs致肺癌过程中可以通过调控长链脂肪酸的代谢紊乱，进而激活PPARγ，从而发挥抑癌基因作用。ACOXL可能在PAHs致肺癌过程发生DNA高甲基化而失活，而ACOXL特异性DNA甲基化编辑可以恢复其表达。4.揭示NNT基因DNA甲基化在顺铂的耐药性的功能及调控机制。我们筛选到NNT基因在顺铂耐药肺癌细胞中出现异常高甲基化而沉默，并且其高甲基化抑制状态和非小细胞肺癌患者的生存率较短有显著的关联。功能研究发现NNT可以通过抑制NAD+/SIRT1活性，进而抑制了细胞自噬，增强肺癌细胞对顺铂的敏感性。我们成功地在顺铂耐药细胞实现了NNT的精确DNA甲基化编辑，可以恢复耐药细胞对顺铂的敏感性，为克服肺癌化疗耐药提供了一种有前景的方法。通过本项目研究，成功建立了特定区域DNA甲基化编辑技术平台，明确了DNA甲基化对基因表达调控的因果关联，深化了DNA甲基化的调控机制研究，并有望进行转化应用。