新疆紫草中紫草素生物合成途径关键基因GHQH的克隆及功能研究

Shikonins are the main active ingredients in Arnebia euchroma, which have a variety of pharmacological effects and great economic value. Geranylhydroquinone 3''-hydroxylase(GHQH), the first enzyme of this modification function found in plants ,is one of key enzymes in shikonin biosynthesis. We gained two cell lines of A. euchroma: the shikonin proficiency red cell line and shikonin deficiency white cell line in previous study. Based on the differences analysis of metabolic profiles and transcriptional expression profiles of red line and white line, we screened and gained the predicted genes encoding GHQH in shikonin biosynthesis. In this program we are going to construct a yeast engineering strain to produce GBA, the substrate of GHQH, and then through, enzymatic reaction in vitro, and whole-cell catalysis to verify the function of predicted GHQH. Meanwhile, in vivo, we will use RNA overexpression and RNA interference of GHQH to clarify the role of GHQH in shikonin biosynthesis. In this study, we intent to clone and analysis the function of gene encoding the key enzyme GHQH in shikonin biosynthesis of A. euchroma by a comprehensive chemistry, molecular biology, bioinformatics and synthetic biology method, and this work will provide a theoretical basis for improving shikonin yields by regulation of gene expression and may help to relief the stress of the wild A. euchroma resources.

紫草素类化合物是新疆紫草中的主要有效成分，其具有多种药理作用和巨大经济价值。香叶烯醌-3'-羟化酶（GHQH）是植物中发现的第一个具有这一修饰功能的羟化酶，是紫草素生物合成途径的关键酶。研究组前期筛选获得新疆紫草紫草素类高产红色系和低产白色系，本研究以红色系和白色系的代谢谱和转录表达谱差异分析为基础，筛选获得紫草素生物合成途径关键酶GHQH基因，并构建酵母工程菌株，获得大量紫草素生物合成过程中GHQH催化底物GBA，通过真核表达、体外酶促和全细胞催化等对筛选获得的GHQH基因进行功能验证。同时从GHQH基因过表达和表达抑制正反两个角度，阐明其在紫草素类形成中的作用。本研究综合化学、分子生物学、生物信息学和合成生物学的方法，进行紫草素生物合成关键酶基因GHQH的克隆和功能分析，可为深入解析紫草素生物合成途径，通过基因表达调控提高紫草素产量提供理论依据，对缓解新疆紫草野生资源的压力有重要意义。

紫草素类化合物是新疆紫草中的主要有效成份，具有多种药理作用和巨大经济价值，由于野生紫草资源稀缺，利用分子生物学技术高效生产紫草素类化合物及其合成途径中间产物一直是新疆紫草的研究热点。紫草素生物合成下游途径中，对苯二酚-2-香叶醌-3’’羟化酶基因（GHQH）是单萜苯醌环化成萘醌前的一步关键修饰。本研究围绕GHQH基因的克隆和功能分析，开展了新疆紫草红色紫草素高产细胞系和白色低产细胞系的悬浮细胞的代谢组及转录组差异分析，对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶基因（PGT）克隆、GBA的异源生物合成平台的构建和GHQH基因的克隆与功能验证。本研究克隆得到3条新疆紫草PGT基因（AePGT、AePGT4、AePGT6），全细胞催化及体外酶促结果显示，AePGT、AePGT4、AePGT6三条基因表达的蛋白均可催化香叶烯基焦磷酸（GPP）的香叶烯基转移到对羟基苯甲酸（PHB）上生成GBA，其中AePGT6蛋白的催化活性最高；构建了GBA高产的StHP6HC菌株，以1 mM PHB为底物，诱导培养StHP6HC菌株48h，GBA的产量达到179.29mg/L，实现了GBA的高效生产；基于转录组数据分析，克隆了15条紫草素生物合成相关CYP450s基因，体外酶促分析表明其中CYP76B74基因表达的蛋白可催化对苯二酚-2-香叶醌（GHQ）生成3’’羟基-对苯二酚-2-香叶醌（3’’HGHQ）；构建了新疆紫草毛状根遗传转化体系，获得了干扰CYP76B74表达的新疆紫草毛状根，CYP76B74干扰型毛状根中紫草素类化合物的含量明显下降，证明了CYP76B74参与到紫草素的生物合成过程中，完成了CYP76B74基因的体内功能验证。本项目发表论文11篇，其中SCI论文4篇，申请专利2项。.本项目顺利完成了预期目标，为紫草素生物合成过程中后续功能基因的挖掘和功能验证提供了材料，为调控基因表达提高紫草素产量提供理论依据，对缓解新疆紫草野生资源的压力有重要意义。