LncRNA4166-miRNA92a-HAND2调控轴逆转肝纤维化的机制研究

The regulatory role of long non-coding RNA (lncRNA) in liver fibrosis is not clear. In our previous studies, the expression of lncRNA4166 and its cis gene: heart and neural crest derivatives expressed transcript 2 (HAND2) increased, its target miRNA92a decreased in human primary hepatic stellate cells (HSC) and cirrhosis patients. It is concluded that they cooperate with HSC activation and liver fibrosis promotion. Then we explore the mechanism of overexpression or suppression genes in lncRNA4166-miRNA92a-HAND2 axis that regulate its downstream target signaling pathway in liver fibrosis and impact on HSC functions of activation, apoptosis in vitro. We also clarify the rule of inhibition lncRNA4166, HAND2 or derepression miRNA92a that reverse liver fibrosis in liver-specific knockout HAND2 mice and liver fibrosis rats induced by DEN or CCl4. Finally, the expression of these genes and their association with prognosis were observed in chronic liver disease of different causes. The results of the study will help us to explore the molecular mechanism of lncRNA4166 in liver fibrosis and provides a new theoretical and experimental basis for the clinical treatment of liver fibrosis.

长链非编码RNA（lncRNA）在肝纤维化中的调控作用尚不清楚。我们前期研究显示人肝星状细胞（HSC）和肝硬化患者中lncRNA4166及其顺式基因心脏神经嵴衍生表达转录子2（HAND2）增高、靶基因miRNA92a降低；它们协同参与了HSC活化而具有促肝纤维化的作用。本课题拟从细胞水平用质粒过表达和siRNA干扰lncRNA4166-miRNA92a-HAND2轴基因，探索其对HSC活化、凋亡等多种生物学功能和下游肝纤维化靶信号通路的影响。并构建Floxed基因法肝脏特异性HAND2敲除鼠和CCl4、DEN肝纤维化鼠模型，从体内角度阐述抑制lncRNA4166、HAND2或去阻谒miRNA92a逆转肝纤维化的作用。最后观察在不同病因慢性肝病中这些基因的表达及与预后的关联。研究结果将有助于从lncRNA4166这一新视角探索肝纤维化分子机制，为临床治疗肝纤维化提供新的理论和实验依据。

【目的】长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）在肝纤维化和肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中的机制尚不清楚，研究目的为了阐述其生物学功能和探寻治疗新靶点。【方法】通过lncRNA芯片筛选和qPCR/Northern blot验证人肝组织、肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)株（LX2）、肝癌细胞株（Hep3B，SUN387等）的lincSCRG1表达。生物信息学分析预测lincSCRG1的靶miRNA/基因，荧光素酶报告及RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）法验证其结合。细胞过表达/敲减lincSCRG1、miR26a、TTP后，MTT、TUNEL、流式细胞、Transwell和免疫荧光方法研究细胞功能变化。【结果】芯片在人肝硬化组织中筛选出1455个异常上调的lncRNAs，其中lincSCRG1上调13.62倍。（1）肝纤维化研究：lincSCRG1在人肝硬化组织和活化的LX2中表达显著升高，且伴随Bcl2、α-SMA和Col I mRNA上调。RBPDB软件预测出TTP蛋白（一种RNA结合蛋白）与lincSCRG1具有结合位点，RNA pull-down和RIP法提示lincSCRG1靶向结合并抑制TTP。敲减lincSCRG1的LX2细胞活化、增殖和迁移减少；S期细胞减少而G2/M期细胞增加；凋亡增加。靶基因TTP通过抑制促炎促纤维化因子MMP2和TNF-α而发挥作用，过表达TTP后LX2活化、增殖、迁移受抑制和凋亡增加。当TTP缺失时，敲减lincSCRG1无法产生抑制肝纤维化作用。（2）肝癌研究：lincSCRG1在人乙肝HCC肝组织和肝癌细胞（Hep3B、SUN387等）中高表达。生物信息学筛选出lincSCRG1 通过抑制miR26a 调控下游靶基因SKP2而起生物学功能，RIP和荧光素酶报告证实lincSCRG1和miR26a相结合并负调控后者。过表达lincSCRG1 或抑制 miR26a后，肝癌细胞呈增殖、克隆形成、侵袭活性增强的改变；而敲减 lincSCRG1 或过表达 miR26a 后，肝癌细胞出现相反的改变。【结论】在HSC中lincSCRG1通过靶向下调TTP蛋白而激活TNF-α和MMP2，产生诱导HSC活化、增殖、迁移和抑制凋亡的促肝纤维