水稻HL-CMS两个不育基因与两个恢复基因互作机理的研究

水稻HL-CMS/Rf系统存在2个不育相关线粒体基因(orf216和orfH79)和2个恢复基因(Rf5和Rf6)，给核质互作机理研究带来困难。本项目利用orfH79和orf216特异分子标记，对大量水稻种质材料进行筛选，创建orfH79和orf216分开的同核近等基因不育系L-orf216和L-orfH79；YTA//YTA/9311杂交和回交创建近等基因恢复系L-Rf5、L-Rf6和L-Rf5-6。采用RT-PCR、qRT-PCR、Northern杂交与花粉育性检测相结合，研究近等基因不育系分别与各近等基因恢复系杂交后代不育基因及恢复基因的表达模式变化；采用Western杂交和凝胶阻滞实验研究2个不育基因和2个恢复基因表达产物间的互作。这对揭示和阐明HL-CMS/Rf系统不育基因与恢复基因互作机制及应用具有重要意义。

水稻HL-CMS/Rf系统存在2个不育相关线粒体基因(orf216和orfH79)和2个恢复基因(Rf5和Rf6)，给核质互作机理研究带来困难。通过不育基因拷贝数分析，证实orf216与orfH79拷贝比为1: 1.5，揭示orfH79和orf216可能独立存在于水稻多环线粒体基因组的不同环上，推测orfH79和orf216在水稻进化早期并非共存。利用orfH79和orf216特异分子标记，对102份AA基因组野生稻和824个栽培稻筛选，得到的仅含orfH79或orf216材料与YTB连续回交，创建了与YTA同核异质的新型胞质不育系L-orf216和L-orfH79，首次证实HL-CMS类型2个胞质不育线粒基因可分。利用Rf5和Rf6特异分子标记，对YTA/9311//YTB连续回交世代筛选，创建了与YTA同质同核的近等基因恢复系L-Rf5、L-Rf6和L-Rf5-6。构建的L-orfH79/L-Rf5、L-orfH79/L-Rf6和L-orfh79/L-Rf5-6，以及L-orf216/L-Rf5、L-orf216/L-Rf6和L-orf216/L-Rf5-6测交群体，花粉育性统计分析表明，Rf5比Rf6更能有效恢复L-orfH79育性，相反，对L-orf216育性恢复Rf6比Rf5更有效；qRT-PCR分析表明orfH79或orf216表达量下降与其育性恢复度呈负相关，并与Western杂交检测的ORF216或ORFH79表达量减少相一致。毕赤酵母细胞诱导表达ORF216蛋白，导致其线粒体ATP合成下降，ROS含量上升，其生长受明显抑制；这与ORF216-RFP融合蛋白定位其线粒体一致。以ORF216蛋白为诱饵筛选到4个互作蛋白，均为水稻线粒体相关蛋白，与电子传递链复合物Ｉ、复合物Ｖ亚基及蛋白翻译因子等有关。克隆并转化3个靶蛋白基因(代号mxI、mxII和mxIII)，超表达mxI能部分恢复HL-CMS系YTA和BT-CMS系SJA的育性；超表达mxIII能恢复HL-CMS系YTA的育性，但不能恢复BT-CMS系SJA的育性；mxII仅实现在HL-CMS系YTA中的超表达，也能部分恢复其育性；遗传转化证实HL-CMS与BT-CMS配子体不育在遗传上的差异。本研究对建立HL-CMS/Rf系统2个不育基因与2个恢复基因互作的分子模型及其应用具有重要意义。