蚜虫类异戊二烯通路关键酶基因的比较功能研究

异戊烯转移酶和萜烯合成酶是蚜虫类异戊二烯通路的关键酶，不仅负责蚜虫保幼激素的生物合成，也负责蚜虫性信息素和报警信息素的生物合成，对于蚜虫的发育、生殖和行为至关重要。我们已从3种蚜虫中分离出5个不同的异戊烯转移酶基因，并对其活性和功能进行了分析。然而，迄今国际上对于蚜虫萜烯合成酶基因的研究并未有进展。最近，通过分析豌豆蚜全基因组序列，我们发现一个编码萜烯合成酶的候选基因，但其功能有待进一步研究。本项目拟在此基础之上，计划通过一系列的分子生物学和生化检测手段，包括基因克隆、重组表达和蛋白纯化、酶促反应体系优化及联酶反应、产物鉴定与分析、定点突变与结构修饰以及酶产物生物活性分析，旨在揭示不同蚜虫（桃蚜、棉蚜和禾谷缢管蚜）中该两个基因的结构差异和功能特点，从而为蚜虫倍半萜烯生物合成通路提供直接的分子证据，具有重要的科学价值。同时，研究中筛选的高活性突变基因或突变酶将为蚜虫的可持续控制提供重要途径。

异戊烯转移酶是蚜虫类异戊二烯通路的关键酶，不仅负责蚜虫保幼激素的生物合成，也负责蚜虫报警信息素的生物合成，对于蚜虫的发育、生殖和行为至关重要。我们从蚜虫分离出多个异戊烯转移酶基因，并发现不同蚜虫的基因拷贝数存在差异，因此有必要对其进行比较功能研究。此外，尽管豌豆蚜全基因组序列已测定完成，但并未发现萜烯合成酶的编码基因。本项目针对上述科学问题，开展了一系列研究，获得如下重要研究结果：（1）从棉蚜和禾谷缢管蚜克隆了编码长链异戊二烯焦磷酸合成酶（DPPS2）两个亚基的cDNA全长序列。通过结构分析，发现两种蚜虫DPPS-1都包含异戊烯转移酶经典的结构域，但DPPS-2不具有该结构域，说明两个亚基是异源的；（2）对蚜虫DPPS的cDNA进行了原核表达和体外活性分析。通过联酶反应发现该酶的两个亚基单独没有活性，只有结合后才具有活性。进一步采用GC-MS对酶促产物进行鉴定，结果表明主要产物是GGPP；（3）对蚜虫DPPS进行了体内活性分析，发现蚜虫DPPS异源表达产物可催化辅酶Q-10的形成。结合前面的研究结果，推测蚜虫DPPS的催化机理为两大步反应。这是国际上第一个有生化证据支持的有关C50生物合成路径的催化机制假说；（4）从棉蚜和禾谷缢管蚜分别克隆了一个短链异戊烯转移酶--香叶基香叶基焦磷酸酯合成酶（GGPPS）基因的全长cDNA。通过结构分析，发现蚜虫GGPPS的结构也包含异戊烯转移酶经典的结构域；（5）对棉蚜GGPPS基因的cDNA进行了原核表达，重组蛋白纯化，并采用棉蚜GGPPS的重组酶在体外进行了联酶反应和酶活性分析，并采用GC-MS技术鉴定了酶促反应产物。结果表明，该酶不仅能接受FPP，而且能接受GPP和DMAPP作为IPP的共同底物，催化产生预期的产物GGPP。这是国际上第一个被鉴定功能的昆虫GGPPS基因；（6）对棉蚜GGPPS基因进行了定点突变和功能分析，为阐明GGPPS蛋白质结构与功能的相互关系提供了线索。本项目所取得的成果有助于从结构和功能上理解蚜虫异戊烯转移酶的特点，从而为蚜虫倍半萜烯生物合成通路提供分子证据，也可为蚜虫报警信息素的生物合成的分子机理提供解释，因而具有重要的科学价值。本项目的成果将为蚜虫的可持续控制提供重要途径。本项目已正式发表论文7篇（SCI），并重点资助博士生3名和硕士生5名。本项目的完成为后续研究奠定了扎实的基础。