OsTAR2对水稻发育多效性影响的分子机理研究

The plant hormone auxin plays crucial roles in regulating plant growth development, including embryo and root patterning, organ formation, vascular tissue differentiation and growth responses to environmental stimuli. The conversion of TRP to IPA occurs through the action of the tryptophan aminotransferase genes, which play a role in embryogenesis, root, vascular, and inflorescence development in Arabidopsis. Tryptophan aminotransferase -like genes from monocots have not yet been reported. In this study, an auxin related mutant arm(t) were obtained from anM2 population of the japonica rice cultivar Nipponbare after EMS mutagenesis. Map-based cloning revealed that target gene is located in an interval of 60-kb on the short arm of Chromosome 1. Sequence analyses showed that the arm(t) contained a single base deletion in first extron of putative alliinase precursor. AtTAA1 (TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE OF ARABIDOPSIS1) shared approximately 66% amino acid sequence identity with the target gene. We renamed the corresponding gene to TAR2 (TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE OF ORYZA SATIVA 2, TAR2). To confirm its function, we will conduct transgenic experiments with different constructs of TAR2 and the morphology, genetics and physiology of arm(t) involved will be analyzed.

在拟南芥生长素合成过程中色氨酸转氨酶催化色氨酸转换到吲哚丙酮酸，该基因突变对胚、子叶、根、侧生器官及维管系统的发育均有影响。水稻中还没有关于该基因的报道。我们在本实验室创建的粳稻品种日本晴EMS诱变突变体库中发现一个极矮突变体arm(t)，突变表型与已报道的生长素相关突变表型类似。利用图位克隆，我们将该基因定位于第1染色体短臂端60kb区间内，测序结果表明目的基因编码色氨酸转氨酶(TAR2)，第1外显子发生单碱基缺失，导致基因提前终止，氨基酸序列与拟南芥TAA1同源率为66%。本研究拟在此基础上通过转基因功能验证、基因敲除、过表达、组织特异性表达分析、生理生化分析等实验，对TAR2基因功能进行深入研究，为探究生长素在水稻叶发育及株高形态建成中的作用，明确水稻及其他禾本科作物重要激素调控机理提供理论支撑。

摘要：生长素作为最重要的植物激素之一，广泛存在于几乎所有的被子植物中。但其合成的分子机理及对水稻的发育调控目前还知之甚少。我们在本实验室创建的粳稻品种日本晴EMS诱变突变体库中发现一个极矮突变体arm(t)，突变表型与已报道的生长素相关突变表型类似。图位克隆结果显示目的基因第1外显子发生单碱基缺失，造成编码蛋白94氨酸酸出发生移码，使编码蛋白在第129氨基酸处提前终止。本项目在此基础上通过功能互补验证了该基因的功能。氨基酸序列分析结果表明TAR2与拟南芥TAA1同源率为66%。另外一个同源蛋白编码基因Os05g0169300与TAR2有68.4%的序列同源性。反转录结果显示该基因由5个外显子和4个内含子组成，基因组DNA全长3871bp，cDNA全长1524bp，编码507个氨基酸，与预测结果有较大差异。15个独立的定点敲除转基因阳性株，均表现出类似于arm(t)的突变表型，RT-PCR结果显示不同株系的定点突变转基因株中目的基因的表达显著降低，这说明arm(t) 突变与定点突变株系一样属于功能丧失型突变。arm(t) 突变体生长素含量显著低于野生型，而互补转基因株中生长素的含量与野生型类似，这些结果均证明TAR2参与水稻生长素的合成，TAR2基因的突变后水稻内源生长素含量不足，进而造成矮杆、窄叶、根发育异常、不育等表型。为了进一步了解目的基因的表达情况，我们利用水稻不同部位进行了TAR2基因表达量分析，结果表明TAR2表达量最高的是根部，茎基部、穗部以及新抽的叶片中也有较高的表达量，这些结果说明，TAR2主要在生长活跃的部位表达。TAR2定位于细胞核中。利用酵母双杂技术我们筛选到了一个TAR2互作基因，一对一互作验证Pull-dwon分析结果均表明葡萄糖苷酶Ⅱβ亚基与TAR2有非常强烈的互作。基因芯片结果显示信号转导，细胞分化等相关基因的表达在突变体中均发生下调；而与几丁质分解，细胞凋亡等相关的基因表达上调，说明目的基因的突变严重影响了水稻的正常生长发育。TAR2的克隆和基因功能研究，为探究生长素在水稻叶发育及株高形态建成中的作用，明确水稻及其他禾本科作物重要激素调控机理提供理论支撑。