利用兰花试管开花结实体系的遗传转化研究

转基因技术可有效地应用于花卉的颜色、形状、花期、香味和抗性育种，但目前在兰花育种中的应用进展缓慢，主要原因是由于兰花组培再生体系建立较难，已有的转化体系基因型依赖性强，转化效率低。在拟南芥上利用种质系统开展农杆菌介导转化的花序浸蘸法是一种高效简便的转化方法，由于兰花独特的生殖生物学特点，以子房内的大量的合子（或幼胚）为受体开展农杆菌介导的遗传转化研究，可望建立一个高效而简便的转化体系。以子房为遗传操作对象时，实验材料有季节性，而且在栽培条件下，由于环境条件难控制，温度、湿度等对果实发育的影响大，难以确认最佳的处理时间，同时由于处于有菌的条件下，遗传操作后病菌的侵染会影响果实的发育。本研究拟在建立石斛兰试管开花结实的基础上，利用子房为受体开展农杆菌介导的遗传转化研究，建立遗传转化体系；并利用该体系将花期调控关键基因FT基因导入石斛中，进行花期调控育种。

研究背景：兰科是世界最重要的商品花卉；兰花新品种的培育多是通过传统的杂交选育而来，其育种周期长（3年左右），且受种质资源的限制，但新品种的选育越来越困难；转基因技术可有效地应用于花卉的颜色、形状、花期、香味和抗性育种，但目前在兰花育种中的应用进展缓慢，主要原因是由于兰花组培再生体系建立较难，已有的转化体系基因型依赖性强，转化效率低。由于兰花独特的生殖生物学特点，以子房内的大量的合子（或幼胚）为受体开展农杆菌介导的遗传转化研究，可望建立一个高效而简便的种质系统转化体系。.主要研究内容：本研究拟在建立石斛兰试管开花结实的基础上，利用子房为受体开展农杆菌介导的遗传转化研究，建立遗传转化体系；并利用该体系将花期调控关键基因FT 基因导入石斛中，进行花期调控育种。.重要结果：.1. 以铁皮石斛为材料，建立了一个建立起了高效的可育花诱导体系，开花诱导率可达40%以上，授粉成功率在90%以上。并观察确定试管果实在30d左右完成授精，形成合子，在80d左右种子成熟。.2.以金钗石斛Dendrobium nobile为受体建立了石斛兰的农杆菌子房注射转化体系，结果表明：子房注射对果实发育具有较大影响，在授粉后10—30 d进行子房注射后，果实脱落；在授粉后45 d进行子房注射，成熟果实注射部位的种子GUS染色率最高，可达18％ ；无菌播种之后，经潮霉素筛选，获得11株幼苗，每株植株均表现出GUS染色反应；随机挑选4株幼苗进行PCR检测，发现均能扩增出预期条带，说明外源基因已经整合到植株基因组内。.3. 采用子房注射法成功地将外源DNA导入五唇兰。结果表明：外源DNA在转化植株成熟果实中种子的GUS染色率达6．7％ ．无菌播种后经潮霉素筛选。获得18株幼苗，每株幼苗切取幼叶及幼根进行GUS检测，均为阳性：随机挑选7株幼苗进行PCR检测．均能扩增出GUS基因和潮霉素抗性基因条带， 说明外源基因已经整合到植株基因组内。.科学意义：.试管开花结实体系可应用于杂交育种以缩短育种周期，对后代植株进行观赏性状的早期筛选；利用兰花种质系统的遗传转化体系操作简单，不受再生体系和基因型的影响 ，可广泛应用于兰花的转基因育种中。