体外快速人工进化抗体技术的研究

To date, there are an increasing number of antibodies having been used successfully in clinical application. Many antibody library construction and screening technologies have been developed to acquire a variety of antibodies. Nevertheless, how to construct an antibody library with high capacity and how to screen high-affinity antibody efficiently are still bottlenecks. This project aims to develop a novel technology for rapid generation of high-affinity antibodies on the basis of the anchored periplasmic expression system displaying ccFv-formatted antibody in combination with flow cytometric precision sorting developed in our previous study. Here, we will focus on isolating and optimizing ccFv-formatted antibodies against human TNF-α and Tim-3 to establish the novel technology. In this study, a human-sourced naïve antibody library will be constructed, from which anti-TNF-α antibody and anti-Tim-3 antibody will be sorted using flow cytometric precision sorting. Subsequently, ccFv-formatted mutant antibody libraries against TNF-α and Tim-3 will be established and expressed on the inner membrane of E. coli through the anchored periplasmic expression sysem (APEx), followed by collecting antibodies with high affinity employing flow cytometry-based precision sorting. This highly-efficient optimization and screening method can be applied for other antibody optimization, which will promote the development of therapeutic antibody.

目前，越来越多的抗体药物被成功用于临床治疗。至今研究者们发展了不少抗体库构建和筛选技术，以期满足获得各种抗体的需求。如何高效构建抗体库和如何高效筛选高亲和力抗体仍然是目前抗体筛选的瓶颈技术。该申请项目旨在构建基于细菌原生质体展示的双链抗体（ccFv）库，并结合我们前期研究中发展的“流式精确分选”，发展一个新型、高灵敏、高效的抗体筛选和优化技术平台。该研究拟通过优化抗TNF-α抗体和抗Tim-3抗体来构建该技术平台。首先我们将构建一个人源天然抗体库，从中筛选抗TNF-α抗体和抗Tim-3抗体；随后构建抗TNF-α抗体和抗Tim-3抗体的ccFv突变库，并利用锚定周质空间表达展示系统（APEx）将表达的抗体锚定在大肠杆菌原生质体表面（内膜表面），通过“流式精确分选”获得高亲和力抗体。这种高效快速的抗体体外进化和筛选方式有望被应用于其他抗体的进化，推动治疗性抗体的发展。

抗体库的构建和筛选是获得和优化抗体的主要途径。然而，传统构建大容量单链抗体库的方法效率低下，且传统流式分选难以有效富集极少数的最优抗体，使抗体的筛选和优化成为抗体研发的瓶颈技术。本项目将细菌原生质体展示双链抗体（ccFv）库的技术与流式精确分选相结合，成功构建了一个高效、高灵敏的抗体体外进化技术平台；并利用该平台成功优化了抗TNF-α抗体、抗6-4PPs抗体和抗p-Tau-A抗体。主要研究进展包括：1）建成了2×108的人源天然ccFv细菌抗体库，且通过流式精确分选观察到抗TNF-α抗体的富集迹象，表明该技术可实现构建109的人源天然ccFv细菌抗体库，且能够利用流式精确分选富集目标抗体；现已完成人外周血大量样本的收集，即将完成3×109人源天然ccFv细菌抗体库的构建。这将有助于日后从该抗体库中获得目标抗体，从而利用本项目构建的抗体进化平台进行抗体亲和力和特异性优化。2）利用大肠杆菌内膜展示系统和流式精确分选画门策略，通过优化抗TNF-α抗体，成功构建了抗体筛选和优化技术平台，大大提高了构建大容量细菌抗体库和富集高亲和力抗体的效率。利用该平台，获得了亲和力提高5倍的抗TNF-α抗体。完成本项目既定目标。3）利用建成的抗体进化平台优化了6-4PPs抗体64M-2对6-4PPs的亲和力（亲和力提高约710倍）。获得的最佳抗体9c3在ELISA、免疫荧光实验和流式分析实验中均表现出比现有抗体更高的灵敏性，且可以用于检测细胞基因组中6-4PPs的修复动态。该抗体将来有望用于进行紫外线引起的黑色素瘤的相关研究和筛选对紫外敏感的人群。4）通过杂交瘤技术获得了针对阿尔兹海默症患者血液中p-Tau-A多肽片段的单克隆抗体，并利用建成的抗体进化平台优化了该抗体的亲和力。获得的抗体有望成为进行阿尔兹海默症相关研究和疾病早期诊断的工具之一。以上结果验证了所构建的抗体进化技术平台对多种类型抗体的优化均十分有效，一定程度上解决了目前抗体库构建和抗体优化效率低、针对性弱的问题。