睾丸特异乳酸脱氢酶-C基因选择性剪接及其功能研究

乳酸脱氢酶-C（Ldhc）基因特异表达于成熟睾丸和精子中，通过参与糖的无氧酵解而在精子的成熟等过程中发挥重要作用，临床上是可作为药物靶蛋白。我们的前期研究发现，Ldhc基因在几种动物中存在选择性剪接现象，因此，本课题以生殖细胞为主要研究对象，采用RT-PCR、细胞培养、Nothern杂交、Western blot等方法，系统分析Ldhc基因在不同动物睾丸组织中的选择性剪接和特点、mRNA丰度以及蛋白表达、与睾丸发育的关系等；分析缺氧等环境因素对Ldhc选择性剪接的影响；探索选择性剪接是否参与非睾丸组织对Ldhc基因的沉寂。本课题的目的是分析Ldhc基因选择性剪接机制是否普遍存在，认识剪接规律及其与睾丸发育的联系，探索Ldhc基因选择性剪接在Ldh基因家族表达调控中的作用。这些研究对认识Ldh多基因家族表达的调控及分子进化、生殖细胞发育生物学、肿瘤的发生及治疗等具有理论和实际意义

课题“睾丸特异乳酸脱氢酶-C基因选择性剪接及其功能研究”（No.30972160）采用基因克隆测序、定量PCR、电泳、Western blot等方法，以牦牛、大鼠为主要分析对象，研究了乳酸脱氢酶（Ldh）基因的选择性剪接。结果表明：（1）Ldh同工酶家族中只有Ldhc存在选择性剪接，并普遍存在于哺乳动物和鸽子中，剪接的主要规律是删除外显子5、4、6、3，但Western blot分析表明，Ldhc剪接体无蛋白表达。热应激和2800m海拔的缺氧处理对Ldhc的选择性剪接未见影响，但缺氧处理增加大鼠睾丸LDH-C4的蛋白表达量。大鼠睾丸组织Ldhc选择性剪接在不同发育阶段都存在，早至10日龄的大鼠睾丸中就存在全长的Ldhc mRNA，43日龄大鼠睾丸中检测到显著量的LDH-C4；（2）性成熟牦牛、性未成熟犊牛和雄性不育犏牛睾丸组织Ldhc基因均存在选择性剪接，但剪接体种类和表达量存在差异，犊牛、犏牛睾丸组织中Ldhc剪接体比例显著高于成年牦牛,提示Ldhc选择性剪接可能参与Ldhc表达的调控，这可能与犏牛雄性不育相关，但因果关系需要进一步研究；（3）大鼠和牦牛实验显示，非睾丸组织（肌肉、肝脏）中存在Ldhc基因的选择性剪接，但其丰度很低，因此，非睾丸组织沉寂Ldhc基因的机制可能主要在转录水平上。在牦牛Ldhc的3’-非翻译区发现了并不常见的CNG甲基化，并且牦牛肌肉和犊牛睾丸表现为Ldhc的3’端非翻译区高甲基化，提示该甲基化有可能参与肌肉和未成熟睾丸Ldhc基因的沉寂，参与调控Ldhc的表达。ldhc核心启动子CpG岛甲基化在成年牦牛肌肉中表现为高甲基化，但在成年牦牛、性未成熟犊牛、成年犏牛睾丸中均相似，表现为低甲基化。成年牦牛和雄性不育犏牛睾丸ldhc核心启动子和3´-非翻译区甲基化程度类似，因此，我们认为犏牛雄性不育与ldhc甲基化无关。