中性粒细胞胞外诱捕网在脓毒症二次感染致急性肺损伤中的作用及机制研究

Nosocomial infection in late stage of sepsis patients is the important reason for the increased mortality, and lung is the most common damaged organ. Recent studies have suggested that although the neutrophil extracellular traps (NETs) is beneficial to bacteria clarification, its excessive formation can cause tissue damage. Our previous study demonstrated that sepsis mouse models exhibit acute lung injury (ALI) after challenge with lipopolysaccharide (LPS), which is characterized by massive neutrophil infiltration and increased NETs formation. Peptidyl arginine deiminase 4 (PAD4) which is the key molecular mediated the formation of NETs was elevated in neutrophils of secondary infected septic mice. Thus, we speculate that PAD4 mediated NETs increasing, leading to acute lung injury aggravation. To test this hypothesis, three specific aims will be focused in this proposal: 1)Establishing mice model of sepsis and secondary infection, performing in vivo and in vitro experiments to investigate the role of NETs in sepsis secondary infection induced acute lung injury; 2)Clarifying the molecular mechanism of ROS-PAD4 regulating NETs formation; 3)Using neutrophil adoptive transfer experiment and inhibitors in vivo to vertify the role of PAD4 and NETs in sepsis secondary infection related ALI, so as to provide new theory basis and experimental evidences for the prevention and clinical therapy of sepsis secondary infection induced ALI.

脓毒症晚期院内二次感染是患者死亡率增加的重要原因，肺脏是受损最重的器官。中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)虽有利于细菌清除，但过量形成可导致机体组织损伤。申请人前期发现：小鼠脓毒症模型注射内毒素模拟二次感染可诱发急性肺损伤(ALI)，肺部中性粒细胞和NETs形成数量增加；NETs形成关键基因PAD4表达上调。由此提出：“脓毒症二次感染时：升高的PAD4促进中性粒细胞过量形成NETs，可能是导致肺损伤加重的重要原因。”为此本项目拟开展以下研究：1)建立脓毒症及二次感染小鼠模型，从体内和体外证实NETs形成过量在脓毒症二次感染中致ALI的作用；2)体外研究中性粒细胞ROS-PAD4调节NETs形成的分子机制；3)采用过继实验及体内抑制剂验证PAD4及NETs产生对二次感染致ALI病理形成的影响。以期揭示脓毒症二次感染中非炎症因子诱发肺损伤的新机制，为预防与治疗相关疾病提供新的理论和实验依据。

尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，严重脓毒症的死亡率仍居高不下，死亡病例多由于细菌引起的院内二次感染及其导致的急性肺损伤（ALI）。阐明脓毒症二次感染致ALI发生发展的病理生理机制，将为脓毒症的治疗提供理论依据。通过前期研究发现，脓毒症二次感染模型小鼠肺组织损伤严重，肺组织中性粒细胞增多，中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成增加。NETs形成关键基因Pad4表达上调，提示PAD4介导的中性粒细胞NETs形成增加在脓毒症二次感染致ALI中的作用。.我们建立了稳定的脓毒症二次感染致ALI模型，根据肺组织病理分析、湿/干重比等评价肺损伤程度。通过对小鼠血浆中的NETs含量进行定量检测，肺组织切片NETs免疫荧光染色，证实脓毒症二次感染模型NETs形成增加。并且采用体内注射DNase干预NETs的形成和体外肺泡上皮细胞系共培养实验反向验证NETs在肺组织损伤中的作用。证实了NETs在脓毒症二次感染致ALI中的损伤作用。随后，我们通过体外研究证实，脓毒症模型小鼠受到二次感染后，形成NETs的能力增强。Western结果表明，NETs形成关键分子PAD4受到ROS及下游信号通路p38和ERK的调控。最后，我们通过中性粒细胞过继转移实验，验证了从脓毒症小鼠模型分离的中性粒细胞转移到野生型对照小鼠后，发生二次感染后仍会导致肺组织损伤加重。而腹腔注射PAD4的抑制剂Cl-amidine，能够减轻脓毒症二次感染对肺组织的损伤作用，降低小鼠死亡率。本研究揭示了中性粒细胞NETs形成及其在脓毒症二次感染致ALI中的作用，并且初步阐明了脓毒症二次感染中PAD4介导的NETs形成过量的分子机制，为治疗脓毒症提供了新的靶点。在相关研究中我们发现幼稚粒细胞也能够形成NETs，并对其形态和NETs形成能力进行了研究，后续还将继续进行深入研究。