香菇中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其隐蔽型真菌毒素的发生规律及特异性基因调控机制研究

In this current research proposal, the fungal strains, types and concentrations of deoxynivalenol (DON) and its masked forms from a total of 200 Lentinula edodes are firstly evaluated by morphological identification, molecular characterization and chemical analysis to obtain the the basic information about the toxigenic types and levels of the seperated strains. Via artificial inoculation of the strains to Lentinula edodes under various factors (temperature, water activity,cultivation time), RNA is extracted and the homologous gene phylogenetic is established to identify the key gene clusters that play important roles on the biosynthsis of the DON and its masked forms. The regulation effects of the conditions on the specific gene clusters are also investigated. On the other hand,after extraction of the Lentinula edodes, the types and contamination levels of DON, masked DON and the related metabolites corresponding to the production of DON and masked DON under different conditions are clearly identified and quantified to develop the metabolic figures. After comparative analysis of the molecular identification and chemical analysis results, the production of DON and its masked forms and the regulation mechanism of the specific mycotoxin-producing gene clusters in Lentinula edodes are revealed to provide the theoretical and fundamental experimental data for the subsequent research on risk assessments of mycotoxin contamination in the whole chain of Lentinula edodes, and are also valuable to substantially improve the safety and quality control standards of Lentinula edodes in the industry.

本项目拟首先通过形态分析、分子鉴定和化学分析等手段确定200份香菇样品中的产毒菌株和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其隐蔽型毒素的暴露种类与含量水平,获得香菇中易污染的真菌种类及其产毒能力等基础信息。然后，将产毒菌株人工接种至香菇基质，在不同因素条件（温度、水活度、培养时间等）下培养，提取RNA，构建同源基因进化树，考察在DON及隐蔽型DON生物合成过程中起作用的关键基因，并研究主要因素对产毒基因蔟表达量的影响规律；提取香菇样品，考察不同因素下DON及隐蔽型DON的种类及表达量，建立次级代谢图谱，探明与DON及其隐蔽型的产生密切相关的代谢小分子，比对分析分子鉴定和化学分析结果，揭示香菇中DON和隐蔽型DON的发生规律及其特异性产毒基因蔟调控机制，为开展香菇中真菌毒素污染的风险评估、完善香菇质量安全控制技术标准提供理论依据及实验基础。

香菇是世界栽培第二的食用菌，由于其味道鲜美且富含蛋白质、矿物质和维生素，广受消费者的喜爱。但是，香菇如果没有干燥充分或者储存不当的话，容易污染真菌，进而产生真菌毒素，给消费者带来了潜在的安全风险。本项目首先对天然的香菇样本中污染的产毒真菌进行研究。结果发现香菇从栽培到贮藏整个过程中主要被哈茨木霉、茄腐镰刀菌、黑曲霉和黑附球菌等真菌侵染，其中茄腐镰刀菌是能够产毒的主要真菌。同时，基于LC-MS/MS，研究建立了香菇中33种重要真菌毒素的准确定量检测技术。对200香菇样本进行检测后，结果发现31个样本受真菌毒素污染(发生率为15.5%)，浓度为3.3-28850.7 μg/kg，其中，10个样本中检测出脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），浓度为6.3 - 33.2 μg/kg。进一步考察不同温度、不同水活度下，不同产毒真菌（茄腐镰刀菌及可能交叉污染的禾谷镰刀菌）的生长情况、基因表达量及DON和隐蔽型DON的产生量。结果发现：（1）温度和水活度均可以影响真菌生长，10 ℃下，真菌的生长最为缓慢；在水活度为0.95 aw的条件下其生长速度明显低于水活度为0.98 aw的条件。（2）茄腐镰刀菌在香菇培养基中可以产生DON毒素，但是产量非常低，仅在两个样本中检测到，分别为127.6±2.6 μg/kg (20 °C, 0.98 aw, 28 天) 和 17.9±4.5 μg/kg (30 °C, 0.98 aw, 28 天)，且不产生隐蔽型真菌毒素，能够寻找到DON合成的关键特异性产毒基因TRI5基因，但表达量很低。（3）禾谷镰刀菌在香菇培养基中可以产生DON及其衍生物3-乙酰化DON（3-ADON），但是产量明显低于玉米、小麦等其它培养基，且不产生其它隐蔽型DON，证明香菇中的活性成分可以有效抑制DON及其衍生物的生物合成。（4）经多元回归分析后，建立线性模型，准确描述不同因素条件、TRI5基因表达量和DON产量直接的相关性，可以预测香菇中DON的污染情况。通过本项目的研究，揭示香菇中DON和隐蔽型DON的发生规律及其特异性产毒基因TRI5 基因的调控机制，为开展香菇中真菌毒素污染的风险评估、完善香菇质量安全控制技术标准提供理论依据及实验基础。