三七皂苷R1对小肠缺血再灌注后神经细胞凋亡的保护及其与NGF、proNGF信号通路的关系

The cells and tissues were damaged more seriously after small bowel Ischemia-reperfusion, accompanied by a lot of cell apoptosis. Therefore, saving the cells that being apoptosis or going to necrosis is the key of preventing the development of I/R. Research shows, proNGF and its receptors' expressional changes were consistent with apoptosis after small bowel I/R in SD rat, and the Notoginsenoside R1 can inhibit the development of apoptosis by down regulating this pathway. What is more, as the adult pattern of proNGF, the neuronal growth signal by NGF is contradistinction. So, how are the NGF signal change after small bowel I/R? If the times between the two signal with one accord? The purpose of this paper is to construct the I/R model in vitro and in vivo by using SD rat, to study the action of NGF and proNGF signal system or the relationship with apoptosis, If Notoginsenoside R1 is by adjusting the NGF and proNGF signal system to reduces the expression of apoptosis in myenteric nerve plexus neurons and mucous membrane, the recovery of motor function. This paper may provid study base for the recovery of bowel tissues after I/R, provid the experimental evidence of finding effective medicine for protecting the transplated bowel.

小肠缺血再灌注(Ischemia reperfusion,I/R)损伤使细胞、组织破坏更加严重，同时伴有大量凋亡细胞的产生。因此，挽救正在凋亡且濒临坏死的细胞，将成为防止I/R进一步发展的关键。先前研究表明，SD大鼠小肠I/R后神经生长因子前体(proNGF)及其受体的表达变化与细胞凋亡变化相一致，而三七皂苷R1可通过下调此信号表达而抑制凋亡发展。再者，作为proNGF的成体，NGF所诱导的神经生长信号与proNGF截然相反。那么，小肠I/R后NGF信号如何变化？两种信号是否存在时间上的先后？课题拟构建SD大鼠体内、外小肠I/R模型，探讨NGF及proNGF在其中所发挥的作用及其与凋亡的关系，三七皂甙R1对神经细胞凋亡及小肠粘膜、运动功能的恢复是否通过调节NGF及proNGF信号通路实现，其机制如何？可为抢救I/R后濒临坏死的肠组织尽快恢复提供研究基础，为寻找保护移植小肠药物提供实验依据。

本研究通过：1、原代培养小肠肌间神经丛细胞，并进行免疫荧光化学染色鉴定；2、将已鉴定的细胞分为12h、24h、48h三个时间点，三七皂苷R1进行干预，观察细胞生长情况，TUNEL染色检测细胞凋亡情况，免疫细胞荧荧光化学染色对NGF及proNGF信号通路各因子进行检测，Real time PCR检测各因子基因表达情况，Western Blotting技术检测检测各因子基因表达情况。3、找出关键因。4、用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果显示：1、成功体外培养并鉴定SD大鼠小肠肌间神经丛细胞。2、小肠神经细胞缺血再灌注损伤后，细胞的凋亡指数增加，细胞突起长度减少，而进行三七皂苷R1干预后，凋亡指数减少，细胞突起长度增加，差异有统计学意义（P<0.05）。3、三七皂苷R1干预后，Real time-PCR检测：NGF信号通路在缺血再灌注后，信号通路各因子下降，而干预后上升。proNGF信号通路在缺血再灌注后，信号通路各因子上升，而干预后下降。Western Blot检测：NGF信号通路在缺血再灌注后，信号通路各因子下降，而干预后上升。proNGF信号通路在缺血再灌注后，信号通路各因子上升，而干预后下降，差异有统计学意义（P<0.05）。4、成功进行了大鼠小肠缺血再灌注模型的制作。5、小肠缺血再灌注损伤后，细胞的凋亡指数增加，细胞突起长度减少，而进行注射三七皂苷R1后，凋亡指数减少，细胞突起长度增加，差异有统计学意义（P<0.05）。6、注射三七皂苷R1后，Real time-PCR检测：NGF信号通路在缺血再灌注后，信号通路各因子下降，而干预后上升。proNGF信号通路在缺血再灌注后，信号通路各因子上升，而干预后下降。Western Blot检测：NGF信号通路在缺血再灌注后，信号通路各因子下降，而干预后上升。proNGF信号通路在缺血再灌注后，信号通路各因子上升，而干预后下降，差异有统计学意义（P<0.05）。7、反正实验表明，Sortilin可能是发挥作用的关键因子。结论为：1、成功分离并培养、鉴定了小肠肌间神经丛细胞。2、三七皂苷R1可在体外或体内保护缺血再灌注后损伤的神经细胞。3、机制可能是通过上调NGF信号通路并同时下调proNGF信号通路，关键因子可能是Sortilin。