BIG2介导的GABAA型受体转运模式及信号调控机制

γ-氨基丁酸A型受体(GABAARs)作为最重要的抑制性神经递质受体，在神经传递、突触建立和神经通路完善等方面具有重要功能。这些功能的发挥取决于它能否被转运到突触后膜的精确位置，并且保持适当的数量。目前其转运模式和信号调控机制尚不清楚。我们已有的研究结果表明GABAARs同囊泡转运的重要调控蛋白BIG2相互作用，而BIG2、驱动蛋白KIF21a 与BIG1存在于同一个复合体中；而且BIG1和BIG2作为A型激酶锚定蛋白可发挥支架作用，为PKA在这一转运过程中的磷酸化调控提供条件。以此为基础我们提出了GABAARs转运模式和信号调控假说，从囊泡转运的关键步骤即马达与运载物的结合和释放入手，拟采用神经元囊泡分离、免疫共沉淀、siRNA、激光共聚焦成像、活细胞延时摄影等方法，旨在证实我们的假说。本项目的实施不仅能揭示相关神经精神疾病的病理机制，而且也为干预和治疗这些疾病提供理论依据。

神经元中细胞表面的GABAARs处于持续的内吞，这一过程不仅调控了在突触位点GABAARs的积累而且影响了突触抑制的效率。在本项目研究中我们发现BIG1和KIF21a与BIG2和GABAARs在梯度Nycodenz漂浮法中各组分中的分布一致；经BIG1免疫沉淀的神经囊泡中含有GABAARs、BIG2以及KIF21a；采用免疫荧光染色发现培养的神经元中BIG1、KIF21a同BIG2、GABAARs共定位。这些结果表明BIG1、BIG2、KIF21a是GABAARs囊泡转运复合体中的重要组成部分；.我们的研究结果还表明，BIG1是GABAARs的一个新的结合蛋白。BIG1的非竞争性抑制剂布雷菲德菌素A(BFA)，或干扰BIG1可显著下降GABAARs在神经元表面的表达水平，并抑制GABA门控氯离子的流入。过表达功能缺失的BIG1突变体BIG1 - E793K，也可导致神经元表面GABAARs显著下降。经蝇蕈醇处理抑制GABAAR的内吞可时间依赖性地增加神经元表面GABAARs和BIG1的表达，并且这种增加可以被荷包牡丹碱抑制。干扰BIG1可抑制蝇蕈醇刺激引起的神经元表面GABAARs的增长。这些数据表明BIG1依赖于其GEF活性在调控GABAARs向细胞表面转运过程中发挥重要功能，并对GABA门控氯离子的流入具有重要的调控作用。.通过采用质谱在BIG1抗体的免疫沉淀中发现了14-3-3zeta，并证明 GABAARS, BIG1, 14-3-3zeta三者在海马组织和神经元细胞中存在于一个复合体中；干扰14-3-3zeta减弱BIG1与GABAARS的结合，而且神经元表面的GABAARs和BIG1均明显减少；在神经元树突和轴突部分WT-BIG1与14-3-3zeta存在明显的共定位，而BIG1-E793K与14-3-3zeta，或者功能缺失的14-3-3 K49E与BIG1的共定位明显减少；BFA或蝇蕈醇可使膜结合的BIG1和WT-14-3-3zeta明显增加，而且荷包牡丹碱则可以逆转蝇蕈醇的作用。BFA或GABA处理可导致与BIG1结合的WT-14-3-3zeta明显减少；表明BIG1和WT-14-3-3zeta的结合主要是在膜上；我们进一步通过信号通路筛选发现PKCμ/MAPK/ERK信号通路参与了14-3-3ζ在BIG1对GABAARβ 的转运调控。