由glmS核酶介导的枯草芽孢杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖代谢网络的动态优化调控

Glucosamine (GlcN) and its derivative N-acetylglucosamine (GlcNAc) have wide applications in the healthcare field. In the previous work, the applicant has constructed an engineered B. subtilis for the production of GlcNAc. It was reported that, the GlcNAc synthesis precursor GlcN6P can bind with glmS ribozyme and then the glmS ribozyme can slice the transcription product, and the slicing site is recognized by the RNAase J1 to further degrade the mRNA, leading to the inhibition of key enzyme GlmS activity. At the same time, central metabolism and peptidoglycan synthesis are the competitive pathway of GlcNAc synthesis, and are also necessary for cell growth. Therefore, how to dynamic regulate and balance the GlcNAc metabolic network is a key issue for GlcNAc synthesis. In this project, on the basis of glmS ribozyme catalytic mechanism, we first construct the glmS ribozyme mutant library via directed evolution and then the glmS ribozyme mutant with lower catalytic efficiency is integrated into the genome to remove the transcription inhibition of glmS ribozyme on GlmS. After that, the glmS ribozyme mutant is used to decrease the flux of competitive pathways, contributing to the glmS ribozyme-guided dynamic regulation of GlcNAc metabolic network. The results obtained in this project will provide the novel regulation element and regulation strategy for the metabolic engineering of B. subtilis.

氨基葡萄糖(GlcN)及其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)在健康保健领域具有重要应用。前期研究中，申请人构建了一株具有较高GlcNAc合成效率的B.subtilis菌株。已有研究表明：GlcNAc合成前体GlcN6P可与glmS核酶结合并激活其对glmS基因转录产物进行自切割，切割位点被RNA酶J1识别并降解mRNA，抑制了关键酶GlmS的转录。同时，中心代谢和肽聚糖合成途径既是GlcNAc合成的竞争途径，又为细胞生长所必须，如何动态调控平衡GlcNAc代谢网络是提高GlcNAc合成效率的关键问题。本课题基于glmS核酶的催化机制，通过glmS核酶定向进化解除其对GlcNAc合成关键酶GlmS的转录抑制调控，并进一步利用glmS核酶弱化竞争途径的代谢通量，在转录水平上实现由glmS核酶介导的GlcNAc代谢网络的动态优化调控，为B. subtils代谢研究提供了新的调控元件和思路。

N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）及其衍生物具有诸多生理功能，市场应用前景广阔。为避免传统的化学水解法造成的环境污染等问题，通过枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）绿色生产GlcNAc的方法得到越来越多的关注。其主要合成途径是以葡萄糖为原料，在酶的作用下依次合成6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、6-磷酸氨糖（GlcN6P）、6-磷酸乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc6P），最后脱磷酸生成GlcNAc。其中，6-磷酸果糖在氨基葡萄糖合成酶（GlmS）的催化作用下生成GlcN6P的过程受到由glmS核酶开关介导的严格反馈控制，该步是GlcNAc合成途径中的重要限速反应。另外，B. subtilis中GlcNAc合成途径受到中心代谢模块和肽聚糖合成模块的竞争。因此，本项目以解除glmS核酶的反馈抑制，和弱化GlcNAc合成的竞争模块为方向展开研究，提升GlcNAc的合成效率。.首先，本项目通过不同策略进行敲除glmS核酶，发现在敲除glmS核酶并在5’端断裂片段下游插入一个trp终止子，可以有效解除glmS反馈抑制。之后，本项目构建了多种glmS核酶突变体以利用其反馈抑制机制，调控中心代谢模块的关键酶6-磷酸果糖激酶（PFK）和肽聚糖合成模块的关键酶磷酸氨基葡萄糖变位酶（GlmM）的表达。在此调控作用下，代谢流被有效的导向GlcNAc合成途径。最终，GlcNAc产量由9.2 g/L达到16.3 g/L，产率增加到2.24 g/g细胞干重，转化率提高到0.394 g/g葡萄糖；同时，副产物乙偶姻由原来的23.3 g/L降低为0。.综上所述，本项目通过解除glmS核酶反馈抑制效应，并利用此效应对竞争途径进行抑制，有效提升了GlcNAc产量，并提升了其转化率，促进了其工业化生产的可能性。基于上述研究，本项目在国内外权威期刊发表论文11篇；出版英文著作2部；获授权中国专利5项，国际专利1项。