乳酸菌磷酸酯酶对有机磷农药的降解模式与机制

Organophosphorus pesticides (OPPs) are a group of chemical pesticides widely used in agriculture presently. Pollution of agriculture products resulted from OPPs residues brings risks to the food safety. Most studies focused on their environmental microbial degradations, recently researches on biodegradation of OPPs via food borne microorganisms have been attacking attention. Lactic acid bacteria (LAB) are widely used in food industry. Recent researches revealed its ability to degrade OPPs. Dozens of strains of LAB with high degradation activity were screened by my team, and their potential relationship with the secreted phosphatase was confirmed, but possible mechanism remains unknown. For this purpose, the phosphatase from LAB in a fermentation system will be isolated and purified by chromatography in this study. The chemistry and catalytic kinetics properties will be analyzed. The purified phosphatase will be applied directly in the OPP degradation. The molecular docking method will be used to investigate the binding modes of OPP to phosphatase.The Composition and content of the decomposition products analyzed by GC-MS were used to reveal the major pathway and pattern of degradation. The research aims of this project are to provide the basis information for the application and screening of food borne microorganisms with high OPP degradation activity.

有机磷农药在农业生产中广泛使用，在农产品中的残留给食品安全带来极大隐患。以往研究大多集中于环境中有机磷农药的生物降解，近年利用食源性微生物对有机磷农药的降解研究引起关注。乳酸菌在食品工业中有广泛的应用，多项研究发现其对有机磷农药具有降解作用。本项目组亦筛选出对有机磷农药具有降解促进作用的几十株乳酸菌菌株，并且确定了乳酸菌磷酸酯酶和有机磷农药降解之间的相关性。但酶的作用机理尚不明确，基于此，本申请课题拟采用层析技术提取纯化乳酸菌发酵体系中的磷酸酯酶，分析酶的化学和催化动力学特性；并将纯化后的酶直接作用于有机磷化合物，用气相色谱质谱联用技术分析有机磷农药的降解产物，根据其组成和结构分析降解途径；用分子对接方法模拟酶与农药的相互作用。重点研究有机磷农药在磷酸酯酶作用下的降解模式与途径，以揭示乳酸菌发酵体系的酶促降解农药作用机理，为实现开发高效降解有机磷农药的食品级菌株的筛选和应用提供基本依据。

有机磷农药的广泛使用促进了全球农产品质量的提升。然而，在关注其带来的巨大功效的同时，更要重视生态环境污染、生物链危害问题。生物降解是去除有机磷农药的有效方法之一，其中酶能够更有效的降解有机磷农药，有研究表明乳酸菌中的碱性磷酸酯酶在农药降解方面扮演重要角色。本项目通过对多株乳酸菌进行筛选，获得一株碱性磷酸酯酶活力最高的菌株。通过全基因组测序，得到该菌株基因组序列完整图，从中找到2个编码碱性磷酸酯酶的基因片段，通过生物信息学手段，分析影响酶活力的因素。优化培养基产酶条件，提高乳酸菌的碱性磷酸酯酶活力。同时将筛选出的乳酸菌应用于MRS培养基体系以及牛奶体系中进行有机磷农药降解实验。采用层析技术提取纯化乳酸菌中的碱性磷酸酯酶，分析酶的化学和催化动力学特性；并将纯化后的酶直接作用于有机磷化合物，确定乳酸菌碱性磷酸酯酶对有机磷农药的降解作用；用分子对接方法模拟酶与农药的相互作用模式，以揭示乳酸菌发酵体系中，酶促进农药降解的作用机理，为实现开发高效降解有机磷农药的食品级菌株的应用提供基本依据。研究结果表明，碱性磷酸酯酶是一种能够催化有机磷化合物中P-O和P-S键断裂的高效水解酶。有机磷农药与碱性磷酸酯酶具有高亲和力，在催化过程中，其中Gln375、Asp55和Thr413是有机磷农药与碱性磷酸酯酶形成主要氢键作用力的关键残基。同时，气相降解实验数据与计算机模拟自由能结果一致，验证了分子对接模式的准确性。采用碱性磷酸酯酶对草甘膦农药进行降解，确定碱性磷酸酯酶以草甘膦为底物的动力学特性，并且开发具有生物降解能力的碱性磷酸酯酶的pH响应型固定化载体，使酶对热、酸的稳定性均得到提高，为实现碱性磷酸酯酶对草甘膦发挥清除作用的实际应用提供基本依据。