广西肝癌高发区MC-LR污染与HBV变异对肝癌发生的协同作用与机制研究

Microcystin-LR can cause liver cell toxicity effect, HBV can lead to hepatocellular carcinoma by mediating various signaling pathway. But it is still poorly understood for the synergy of both. This project found microcystin-LR in water source of high incidence area of liver cancer in Guangxi through preliminary experimental, the HBV infection rate was high in local people and some HBV variations connected with hepatocellular carcinoma, but the interaction mechanism of them remains to be further discussed.So this project hypothesized that MC - LR associated with HBV mutants can lead to DNA oxidative damage effect and inhibition of PP2A activity to regulate the expression of downstream MAPK family protein and result to hepatocellular carcinogenesis. To test this hypothesis, this study will combine the epidemiology with cell molecular biology, to firstly investigate the relationship between microcystin-LR exposure and HBV infection, variation with hepatocellular carcinoma in the high incidence area of liver cancer in Guangxi by ecology study, then explore the cell effect and regulatory mechanism of MC - LR joint with HBV by virus transinfection, MTT, FCM, genetic toxicity test, antioxidant intervention, Western blot and so on from the perspective of the oxidative stress and phosphorylation in cell and molecular level. It is expected to provide scientific data and theory reference for the comprehensive prevention and treatment of hepatocellular carcinoma.

微囊藻毒素-LR(MC-LR)能引发肝细胞毒性效应,HBV可通过多种信号通路诱导肝细胞癌变，迄今对两者能否产生协同作用知之甚少。本项目的预实验发现广西肝癌高发区水源存在MC-LR，当地人群HBV感染率高且某些HBV基因变异与肝癌发病相关，但两者相互作用的机制有待进一步探讨。为此本项目提出：MC-LR与HBV变异可联合导致DNA氧化损伤效应和抑制PP2A活性、调控下游MAPK家族蛋白表达而引起肝细胞癌变。为验证这一假说，本项目拟采用流行病与细胞分子生物学结合的研究设计，首先在广西肝癌高发区开展MC-LR暴露及HBV感染、变异与肝癌关系的生态流行病学研究，再采用病毒转染、MTT、FCM、DNA损伤检测、抗氧化剂干预、Western blot等手段，在细胞分子水平从氧化应激效应和磷酸化的角度探讨MC-LR与HBV变异联合作用的细胞效应及调控机制。预期结果可为肝癌的综合防治提供科学数据及理论参考。

广西肝癌高发区水源水中有微囊藻毒素污染，但污染程度及其与HBV感染变异对肝癌的协同作用尚未明确。本研究试图建立一种高效液相色谱法检测广西肝癌高发区不同水源中微囊藻毒素-LR（MC - LR）的浓度；阐明不同水源地MC - LR水平与肝癌高危人群肝脏疾病的关系；最后在体外用细胞模型探索MC - LR与C端截短HBX对HepG2细胞的协同效应及其介导的蛋白磷酸化和氧化应激效应。结果显示：（1）本研究所建立的高效液相色谱法所检测的MC - LR在 0.05 ~1.0 µg/mL 范围内线性良好（r2 = 0.9987），回收率在90% ~110%之间，检出限为0.028 μg/L。（2）广西肝癌高发区水源水中的井水和河水，末梢水中的井水、河水和水库水以及池塘水MC - LR平均浓度分别为48.845ng/L，72.790ng/L，33.550ng/L、55.045ng/L，88.605ng/L和140.605ng/L，差异有统计学意义（P < 0.05）。末梢水和池塘水中5月的MC - LR水平高于10月（P < 0.05）。MC - LR水平主要受水中总磷含量的影响（P < 0.05）。（3）广西肝癌高发区饮用水MC - LR含量与肝脏疾病史和肝脏疾病指标如HBsAg阳性和谷丙转氨酶≥40U/L等呈正相关（rs = 0.603，P<0.05）。（4）以MC - LR干预转染了C端截短HBX的HepG2细胞，ELISA法检测实验组的蛋白磷酸化酶2A活性发现其下降幅度大于对照组 (P < 0.05)；细胞增殖、迁移、侵袭和集落形成能力增强 (P < 0.05)；S期细胞比例高于未处理组(P < 0.05)。MC - LR+HBX△32可上调MAPK信号通路mek1 /2、ERKl/2、p38和JNK磷酸化蛋白的表达，同时激活细胞周期相关蛋白p53、cdc25C、cdc2的表达 (P < 0.05)。（5）同时用荧光探针法检测发现ROS水平与MC - LR浓度和干预时间呈正相关；qPCR和WB法检测氧化应激相关基因和蛋白水平，发现实验组MAOA基因表达上调，UCP2、GPX1基因表达下调，相应蛋白表达水平与mRNA的改变一致（P < 0.05）。本项目阐明了MC - LR暴露与HBV感染的联合致癌效应，从环境、病毒和遗传等多角度为肝癌的病因学和发病机理研究提供实验和理论依据。