miR-31/p21相关信号通路调控角膜缘干细胞生物学特性的的机制研究

The fate of the adult stem cells is closely related with its surrounding microenvironment. To explore the essence of the maintenance of the functional properties of limbal stem cells(LSCs),we have designed the ES microenvironment culture system. In our previous studies, we have found that corneal epithelial cells could be dedifferentiated and retained the undifferentiated phenotype in ES microenvironment. Furthermore, this culture system could maintain the stemness of LSCs via telomerase-p21-mitochondria axis and the activation of FAK/Wnt signaling pathways.Studies have shown that microRNAs could regulate the functional properties of adult stem cells. Based on our previous work, we propose to confirm and consummate the mechanisms of ES microenvironment regulating the functional properties of LSCs : 1. To verify the activation of miR-31/FIH-1/p21 signaling pathway plays vital roles in the maintenance of functional properties of LSCs and the regulation of its apoptosis; 2. To confirm the roles of p21/Survivin in LSCs; 3. To figure out the mechanisms of miR-31 in maintenance the functional properties of LSCs. This project will focus on the scientific problem "the essence of ES microenvironment", aim to disclose the mechanisms of ES microenvironment maintenance the functional properties of adult LSCs based on the regulation of the microRNAs, and to provide novel scientific strategies and research platform for ocular surface resconstruction.

成体干细胞的命运与其生存的微环境密切相关。为探讨角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs)功能特性维持的本质，我们设计了胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ES)微环境培养体系，发现其可以使角膜上皮细胞去分化，并且能够通过端粒酶-p21-线粒体通路以及FAK/Wnt信号通路的激活维持LSCs的干性。研究表明，microRNAs具有调控成体干细胞生物学特性的功能。结合前期的工作积累，本项目拟进一步：1.证明miR-31/FIH-1/p21信号通路的活化参与LSCs干性维持与凋亡的调控；2. 明确p21/Survivin的作用；3.揭示miR-31维持LSCs功能的机制。本项目紧紧围绕"ES微环境作用的本质"这一科学问题，从microRNAs调控机制入手，旨在阐明ES微环境调控LSCs功能的机制,为眼表重建提供新的策略与研究平台。

角膜上皮细胞的更新依赖角膜缘干细胞的功能特性。微环境在细胞功能特性的维持上发挥了非常重要的作用。先前的一系列研究表明在ESC-CM 中培养的兔角膜上皮细胞的功能特性可以得到增强。胚胎干细胞微环境可以通过端粒酶-P21-线粒体与FAK/Wnt 信号通路的激活促进角膜缘干细胞未分化状态的维持及抑制其凋亡。miRNAs，是短的非编码寡核苷酸链。miRNA 在调节细胞进程中具有非常重要的作用，包括分化、增殖、迁移与凋亡。在人类角膜，有多种miRNAs在进行表达。其中，miR-143与miR-145在LSCs中高表达，而在TDCs中则低表达。然而，miR-184与miR-31则在TDCs中高表达，而在LSCs中低表达。因此，我们拟对miR-31/FIH-1/P21相关信号通路在ESC-CM 维持LSCs 功能特性中的作用进行探讨，将成为机体组织特异性的成体干细胞研究的代表模型。我们检测了在ESC-CM 培养条件下miR-31及其相关信号通路在LSCs细胞表型、生物学功能、增殖能力、细胞周期、细胞凋亡等方面发挥的作用。我们的研究结果表明，miR-143与miR-145在LSCs中的表达量明显高于在TDCs中的表达量，而miR-31与miR-145在LSCs中的表达量则明显低于TDCs细胞。当miR-31下调时，我们发现miR-143,miR-145上调。miR-31是角膜上皮特异表达的microRNA。FIH是miR-31的靶基因。结果表明在经过miR-31mimic 处理之后，FIH-1的表达量会出现下调。重要的是，在antago-31处理之后，FIH-1的表达量出现上调。同时，我们观察到在较低的miR-31水平时，LSCs 可以保持较好的干细胞功能特性。在经过Antago-31处理之后，P63、ABCG2的表达量上升，而CK3的表达量下调。因此，miR-31可以作为重要的调节分子参与角膜缘干细胞分化的调控。我们的研究表明ESC-CM 可以通过抑制 miR-31/FIH-1/P21通路，激活e FAK/Wnt信号通路促进LSCs干性的维持并抑制其凋亡。本研究将对microRNAs 在眼表疾病的研究提供参考，并促进角膜相关的miRNAs治疗性药物的研发。