p53信号通路在泡状棘球蚴发育调控中的功能和作用机制

泡状棘球蚴病是一种严重危害人体健康、被我国列为重点防治的人兽共患病。.p53及其相关信号通路在调控细胞生命活动中发挥重要作用。本课题将克隆泡状棘球蚴p53基因，利用生物信息学、酵母双杂交及免疫沉淀技术对其基因结构和生物学功能进行鉴定和分析。表达重组蛋白，制备抗体，采用RT-PCR、原位杂交和免疫组化技术对其进行表达水平和定位分析。在体外培养体系基础上，对p53在泡状棘球蚴不同发育时段和不同培养条件下的表达活化情况进行研究，重点分析泡囊出芽增殖初期生发层细胞中p53的表达活性。同时通过使用p53抑制剂阻断相关信号途径，体外模拟宿主免疫细胞造成的氧化损伤以及结合动物感染实验，研究p53信号通路在细胞发育增殖、DNA损伤修复、细胞凋亡和抵御宿主免疫杀伤过程中的作用机制。从分子生物学水平认识泡状棘球蚴在寄生过程中的发育调控机制，为以p53及其相关蛋白为作用靶点的棘球蚴病药物研发奠定理论基础。

泡状棘球蚴病是由多房棘球绦虫(Echinococcus multicularia, E.m)幼虫寄生所致的人畜共患寄生虫病。该病被认为是最致命的蠕虫感染病，是我国目前主要防治的寄生虫病之一。p53是一种重要的转录调控因子，参与多种细胞生命活动的调控，包括细胞周期调控、细胞增殖与凋亡、DNA损伤修复等。本项目在我们前期工作基础上，克隆出多房棘球绦虫p53全长基因序列。结合基因预测、定位等生物信息学分析，结果显示emp53基因全长约4.8kb，含9个内含子，仅存在一种转录剪切体形式，编码序列CDS为2079bp。其编码氨基酸序列中的p53-DNA结合结构域高度保守，三级结构预测表明其与哺乳动物p53蛋白三级结构相似。EMSA实验表明Emp53蛋白可与公认的p53结合DNA序列结合，表明其可能参与了泡状棘球蚴的基因转录调控。随后我们将其N-端130个氨基酸进行了原核表达并制备了多克隆抗体（Emp53-Ab1）。Emp53-Ab1可以与体外原核/真核表达的全长Emp53蛋白特异结合，同时亦能用于WB实验和IHC实验检测不同发育时期泡状棘球蚴（原头节、囊泡）中的Emp53。利用WB实验和qRT-PCR我们发现，在H2O2刺激后，Emp53其转录水平和蛋白水平均显著上调，表明Emp53参与了氧化胁迫的应激反应，提示其在对抗宿主免疫细胞攻击产生的ROS应激反应中发挥作用。TUNEL实验结果表明UV照射会引起泡状棘球蚴的细胞凋亡。UV介导的细胞凋亡在加入p53抑制剂Pifithrin-α后，细胞凋亡数目显著减少。说明Emp53参与调控了泡状棘球蚴体内DNA损伤引起的细胞凋亡。通过体外转染p53-/-细胞株H1299，我们发现Emp53可以部分恢复UV介导的细胞凋亡，表明Emp53具有类似哺乳动物p53调控DNA损伤引起的细胞凋亡的功能，而且这一调控机制和通路与哺乳动物相似。qRT-PCR实验结果表明体外培养的原头节和囊泡，囊泡生长迅速期和平缓期中的Emp53其转录水平并无显著差异。本课题首次鉴定了寄生蠕虫p53基因，填补了p53基因在这一动物类群中的进化地位和功能作用的研究空白。阐明了寄生过程中p53在泡状棘球蚴发育增殖、细胞凋亡、DNA修复及抗氧化损伤的功能机制，为以p53及其相关蛋白为作用靶点的棘球蚴病药物研发奠定了基础。