ABCB11基因错义突变致儿童肝内胆汁淤积症分子机制及干预研究

Bile salt export pump (BSEP) is the principal conveyor of bile acids from hepatocyte cytoplasm into bile canaliculus. The protein defects can result in progressive familial intrahepatic cholestasis 2(PFIC2). In cases of PFIC2, the initial presentation are jaundice from the first months of life and the rapid appearance of liver failure, also the early hepatocellular carcinoma (before 1 year of age). Our group has established BSEP overexpression system in HEK293 and Huh7 cell lines, and confirmed that Y472C、I669V and D1131V mutations significantly reduce BSEP membrane expression. This study will further utilize the existing BSEP eukaryotic expression system to investigate the influence of 17 ABCB11 gene missense mutations on the expression, localization and transport activity of BSEP in Chinese population, which will provide an important basis for the clinical diagnosis and genetic counseling of PFIC2. More importantly, recent studies have shown that molecular chaperone drugs promote the correct folding and transport of mutants to increase the membrane expression of BSEP and is a new herapeutic strategy of PFIC2. On the basis of functional data of ABCB11 gene mutations, we next want to explore the effect of vx-809 and other chaperones on endoplasmic reticulum traffic mutants, which will provide new prospects for the treatment of children with PFIC2.

胆盐输出泵（BSEP）是肝细胞膜上主要的胆盐外运载体，其基因（ABCB11）缺陷可导致进行性家族性肝内胆汁淤积2型（PFIC2）。PFIC2患儿出生即发生进行性加重黄疸，可很快进展为肝衰竭而需要肝移植，目前尚缺乏有效治疗方法。本课题组前期已在多种细胞系建立BSEP过表达体系，并证实I669V等多个ABCB11错义突变显著降低BSEP膜表达。本研究将进一步利用现有的BSEP体外真核表达体系探讨中国人群中的17种ABCB11基因错义突变对BSEP表达、定位和转运活性的影响，将为PFIC2的临床诊断和遗传咨询提供重要依据。近期研究显示分子伴侣类药物促进突变蛋白的正确折叠和运输，增加BSEP膜表达是PFIC2患儿非常有前景的分子靶向药物疗法。本研究将在BSEP错义突变功能分型的基础上，进一步探讨VX-809等分子伴侣类药物对膜蛋白减少/缺失型突变体的纠正作用，将为PFIC2患儿的治疗提供新的前景。

胆盐输出泵（BSEP）是肝细胞膜上主要的胆盐外运载体，其基因（ABCB11）缺陷可导致进行性家族性肝内胆汁淤积2型（PFIC2）。PFIC2患儿出生即发生进行性加重黄疸，可很快进展为肝衰竭而需要肝移植，目前尚缺乏有效治疗方法。因此，对ABCB11基因变异进行功能研究，辅助患者家庭进行产前诊断和遗传咨询，对于减少PFIC2出生缺陷的发生是有重要防控意义的。同时，研究ABCB11基因突变的内在致病分子机制，对于ABCB11缺陷患者的个体化治疗、预后评估具有重要的临床意义。本研究首先构建了体外ABCB11基因mini-gene剪接报告系统，在体外验证了IVS21-2A>T，IVS6+5G>A和IVS14+1G>C三种剪切突变对mRNA组成型剪接的影响，研究结果为ABCB11基因缺陷的患儿家庭的产前诊断和遗传咨询提供了实验依据。同时，本研究中我们阐明了PFIC2患儿ABCB11基因复合杂合型变异（c.76+29T>G 和c.390-2A>G）的致病机制，同时在国内外首次将ASO应用于ABCB11基因异常剪接的纠正，证实ASO具有治疗c.76+29T>G变异导致PFIC2的作用，为今后PFIC患者内含子变异的ASO治疗研究提供了依据，具有潜在的临床转化价值。最后，成功应用CRISPR/Case9技术构建了abcb11b基因敲除斑马鱼模型，并通过abcb11b-/-纯合子斑马鱼系转录组学测序，对abcb11b基因缺失导致下调的基因进行了功能富集和KEGG通路分析。