新城疫病毒F蛋白在诱导肿瘤细胞自噬过程中的机制研究

Newcastle disease virus （NDV）could specifically induce apoptosis in tumor cell by activate p53 independent intrinsic apoptosis signal passway,thus NDV is hopeful to become a new biotherapeutic medicine in tumor treatment area.the activity change of autophagy has a inseparable relationship with apoptosis which hasbecome a new target in tumor therapeutic area. Latest investigation revealed that NDV could induce autophagy in U251 tumor cells and apoptosis later. But it is still unclear about which protein and mechanism the virus used in this progress. In this study, we will use reverse genetics technology to construst recombinant virus by exchange the F protein of lentogenic strains and velogenic strains.Our previous study shows that recombinat NDV with different virulence F protein could induce autophagy in different extent in HepG2 cell.the virulence of NDV has a close relation with its tumor killing capability, so we decide to find out the effect of F protein,which determin the virulence, in autophagy progess after infection,including dynamic analysis of relative cytokine and signaling pathway transduction.Our study will reveal the function of F protein in autophagy progress, futher to disclose the molecular mechanism of NDV inducing autophagy and tumor killing.Our study will offer new theory for tumor treatment and foundation for seeking new method in tumor prevention and therapy.

新城疫病毒（NDV）可通过启动不依赖p53的内源性凋亡通路，特异地引起肿瘤细胞凋亡，有望成为肿瘤治疗领域新的生物治疗药物。自噬的活性的变化与肿瘤的发生、发展、凋亡密切相关，已成为肿瘤治疗领域新的靶点。最新研究表明NDV可以引起某些肿瘤细胞发生自噬，并在后期诱导细胞发生凋亡。然而，NDV诱导自噬发生的蛋白和机制尚不清楚。本实验室将NDV强毒F蛋白替换弱毒Clone 30的F蛋白获得重组病毒，前期结果显示，携带不同毒力F蛋白的新城疫病毒可引起HepG2细胞不同程度的自噬。由于新城疫病毒的毒力与肿瘤的杀伤能力关系密切，而F蛋白直接决定NDV的毒力强弱，因此本研究围F蛋白深入研究在病毒感染后对自噬过程的影响，动态分析相关细胞因子和信号通路的变化情况。本研究将揭示NDV的F蛋白在自噬过程中的作用，进而明确NDV诱导自噬及杀伤肿瘤的分子机制，为寻找肿瘤治疗和预防的新方法奠定基础。

本研究为进一步清晰阐明F蛋白在诱导肿瘤细胞在自噬过程中的作用，采用反向遗传操作技术对NDV弱毒（F0株）的F裂解位点进行改造，通过分子构建使其突变为强毒裂解位点（F3株）。通过感染HepG2肿瘤细胞，观察自噬进展变化，从而揭示不同毒力F蛋白NDV对自噬进展的影响，并探讨背后机制。.计划进行了三方面的研究：.1.用不同毒力的F蛋白对HepG2细胞进行感染，对自噬程度进行金标准检测。.2.研究NDV F蛋白在NDV引起的肿瘤自噬过程中，对自噬关键信号通路class III PI3K/Beclin-1和classIPI3K/Akt/mTOR的影响.3.对F蛋白进行真核表达载体的构建并加上HA与Flag标签，采用pull-down方法寻找与F蛋白相结合的细胞因子，通过免疫荧光共定位技术对分离到的蛋白进行验证分析；.研究发现1.不同毒力F蛋白可引起不同程度的细胞自噬。.2.在预实验中结果显示24小时，48小时自噬程度逐渐增加，并且也有文献称病毒感染后从2小时至48小时，自噬程度逐渐升高。.但是在深入研究后意外发现，由于HepG2细胞自噬本底较高，因此NDV病毒感染初期2-6小时，LC3-I与p62会升高，会对细胞本底自噬进行抑制，因此，这一现象改变了目前对NDV入侵、感染的过程中对自噬的认识，因此对其具体机制进行进一步研究。.3. 构建了带flag标签的真核表达载体，但WB无法检测到F蛋白。查阅参考文献发现NDV其他5个蛋白都能由构建的真核表达载体表达，同样对F蛋白无法检测。分别构建了F1和F2携带Flag标签，仍然无法检测表达。.此外，在执行过程中为兼顾研究成果的产业化应用，利用反向遗传操作技术，分别构建了重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）和白细胞介素-2的NDV病毒，命名为Anh-TRAIL和Anh-IL-2，并在细胞水平动物水平对其肿瘤杀伤效果进行了检测和评价，为后期临床应用研究奠定基础。.在研究过程中同时发现，近年来针对增强抗肿瘤T细胞应答的免疫疗法，开创了肿瘤治疗的新时代。通过近年NCS等重量级期刊对肠道微生物的报道发现，PD-1/PD-L1抑制剂等免疫疗法无效，可能与肠道微生物有密切关系。因此，本研究希望探索NDV强弱毒，在肿瘤治疗过程中，治疗效果与肠道菌群之间的联系。对治疗肿瘤过程中菌群的变化进行了16s测序、分析，对该领域进行了探索性研究。