一氧化氮与环氧合酶相互作用机制研究

Cyclooxygenase (COX), with coupled peroxidase and dioxygenase activity, is an essential metalloenzyme responsible for the biosynthesis of prostaglandin H2 in organisms. This enzyme plays critical roles in several physiological and pathological processes, and can be the target for common anti-inflammation medicines such as aspirin and ibuprofen. It has been reported that there is an interaction between NO and COX, but many conflicting results exist due to the neglect of the influence of oxygen species concentration such as oxygen and hydrogen peroxide on enzymatic activity. In this study, COX enzymes were purified and prepared under strict anaerobic conditions for the first time, so as to unify the initial oxygen concentration in the determination of enzyme activity. We will investigate the mechanisms of interaction between NO and COX at different oxygen or hydrogen peroxide concentrations, using kinetics isotope effect (KIE) probe, enzyme kinetics, thermodynamics and other spectroscopy methods. The novel findings would supply useful implications for the development of mechanism-based specific inhibitors, targeting new metabolic networks with fewer side effects.

环氧合酶（cyclooxygenase, COX）是生物体内参与前列腺素合成的一种关键金属蛋白酶，具有偶联的过氧化物酶和双加氧酶活性。研究发现该酶在许多生理和病理过程中发挥重要作用，是常见抗炎类药物如阿司匹林、布洛芬等的作用靶点。虽然已有NO与COX存在相互作用的报道，但是相关研究因为忽视了氧气、过氧化氢等氧物种（oxygen species）浓度对NO存在形态以及酶活性测定的影响，造成了许多相互矛盾的结果。本课题将首次在严格厌氧条件下纯化和制备COX蛋白，从而统一了酶活性测定时起始氧气的浓度。通过动力学同位素探针技术、酶动力学、热力学及其它光谱学手段探索在不同氧气或过氧化氢浓度下NO与COX的相互作用机制，为开发基于酶催化机理、针对新的代谢网络、副作用小的抗炎药物提供指导性意见。

环氧合酶（cyclooxygenase, COX）是一种在人体内参与前列腺素合成的关键金属蛋白酶。该酶在许多生理和病理过程中发挥重要作用，是常见抗炎类药物如阿司匹林、布洛芬等的作用靶点。随着研究的深入，人们发现将COX-2作为单一的抑制靶标设计药物并非最佳选择，可能打破代谢网络的平衡，引起心血管、脑中风等疾病。虽然已有NO与COX存在相互作用的报道，但是相关研究因为忽视了氧气浓度对NO存在形态以及酶活性测定的影响，存在亟待解决的争议性问题。. 本项目（1）建立了在厌氧条件下表达、纯化和重组血红素辅基，制备人源COX-1和COX-2蛋白方法；（2）证明了NO不与COX蛋白的血红素辅基发生直接配位作用；（3）利用H/D KIE和18O KIE动力学探针技术分析了NO能够激活COX-2而不激活COX-1的动力学基础，并证明了COX-2蛋白C526的亚硝基化会改变AA结合通道的几何构造，促进底物的进入或者产物的释放，而上述作用对COX-1蛋白AA结合通道的改变不明显；（4）揭示了NO激活COX-2的分子机制：通过加速氢原子从底物AA上的消除，达到增强COX-2酶活的效果；（5）在生理氧气浓度条件下，利用ITC技术研究了小分子抑制剂与COX-2和亚硝基化COX-2蛋白的相互作用，发现NO互作后的COX-2蛋白与抑制剂的结合能力显著增强。. 本课题的研究成果为后续开发更有效的COX-2特异性抗炎药物提供了指导性原则。