鬼臼毒素纳米脂质载体膜剂的宫颈靶向性及对HPV感染的人宫颈上皮细胞凋亡的研究

宫颈尖锐湿疣（CA）的传播和蔓延是当今困扰医学界的难题之一，其在我国女性的发病率不断上升。现有的各种治疗宫颈CA的手段均有较高的复发率。高危型HPV在宫颈黏膜部位的持续感染与宫颈癌的发生密切相关。鬼臼毒素（POD）酊剂是WHO推荐治疗CA的最有效的一线药物，其主要缺点是药物靶向性差，系统吸收毒性大，限制了其在宫颈黏膜部位的临床应用。凋亡在清除病毒感染的细胞过程中具有重要作用。本研究在原有脂质体及皮肤靶向性研究的基础上，制备鬼臼毒素纳米脂质载体（POD-NLC）膜剂，并研究其毒理学作用；应用激光共聚焦显微镜观察其在宫颈的靶向分布；以HPV感染的人宫颈上皮细胞作为靶细胞，研究其对细胞的凋亡诱导及作用机制，以便研制出系统吸收毒性低，具有较强靶向性和良好药效学的POD纳米制剂，为有效治疗宫颈CA、治疗宫颈HPV潜伏感染和宫颈癌前病变以及预防宫颈癌的发生开辟一条新途径，具有良好的社会经济效益。

宫颈尖锐湿疣（CA）的传播和蔓延是当今困扰医学界的难题之一，其在我国女性的发病率不断上升。现有的各种治疗宫颈CA的手段均有较高的复发率。高危型HPV在女性宫颈黏膜部位的持续感染与宫颈癌的发生密切相关。虽然鬼臼毒素(POD)是特效药且其酊剂一直是WHO推荐治疗皮肤CA的最有效的一线药物，但由于其系统吸收毒性大且粘膜靶向性较差，故禁用于宫颈、阴道等粘膜部位。本课题组通过长期的实验研究，采用乳化蒸发-低温固化法，设计正交实验不断优化制备工艺和配方，成功制得0.5%POD纳米脂质载体(POD-NLC)。利用马尔文粒径仪、高速离心-HPLC法和电镜等方法对其理化性质进行考察，结果显示POD-NLC具有稳定性好、包封率高，纳米粒径小等优点，其处方简单、制备工艺可行。以西藏小型猪为实验动物模型，研究宫颈黏膜外用POD-NLC的靶向性及其毒理学实验，结果显示，POD-NLC具有缓慢释放和系统吸收少的特点，安全性高于酊剂。本研究亦初步探索了POD-NLC通过非Caspase依赖途径、线粒体途径和内质网应激途径诱导人永生化阴道上皮细胞(VK2/E6E7细胞)凋亡的机制研究。结果显示，POD-NLC能够作用于VK2/E6E7细胞bcl-2、bax、Caspase-3、Caspase-9，也能诱导VK2/E6E7细胞ROS水平增高，上调AIF、Cyt-C、GRP78、GRP94、calpain2等表达，并可浓度依赖性的增加细胞内Ca2+浓度。提示非Caspase依赖途径、线粒体途径和内质网应激途径凋亡通路均参与POD-NLC诱导VK2/E6E7细胞凋亡的发生，说明其作用机制不是单一的，而是多种因素相互作用的结果。本研究从分子生物学的角度进一步证实了POD-NLC可诱导HPV感染细胞发生凋亡，进而成功清除病变细胞，达到临床治疗CA、有效抗CA复发和HPV潜伏感染的目的。本课题组研制的POD-NLC已申请国家发明专利1项，目前顺利通过国家知识产权局初审、公布及实质审查程序阶段，现在进一步审查中。综上所述，本课题组制得的POD-NLC具有良好的稳定性、黏膜靶向性和安全性，且具有抗HPV复发和抗HPV潜伏感染的疗效，为皮肤科抗粘膜及皮肤的CA复发和HPV潜伏感染提供新的思路，具有良好的社会经济效应。