稻瘟病菌LIM结构域蛋白的生物学功能及与MgLDB1的相互作用

在先前的研究中，鉴定了一个新的稻瘟病菌致病相关基因MgLDB1 （MG01057.6），Δmgldb1突变体在CM培养基上生长缓慢，丧失了产生无性和有性孢子及对感病寄主的致病性。MgLDB1含有一个LIM-bind结构域，进一步的生物信息学分析显示，在稻瘟病菌基因组中包含4个编码LIM蛋白的基因（MGG_06198.6、MGG_04377.6、MGG_05738.6和MGG_04186.6），研究这些LIM蛋白的生物学功能及其与MgLDB1的互作，对进一步阐明MgLDB1的作用方式和功能具有重大意义。本项目将采用基因敲除和互补的策略研究LIM蛋白的生物学功能，同时，用酵母双杂交的方法分析MgLDB1与上述4个LIM蛋白之间的相互作用。研究结果将揭示LIM蛋白在稻瘟病菌营养生长、生殖、致病等过程的功能及MgLDB1作为协同调控子的作用。

LIM结构域是一种进化上高度保守的双锌指结构，LIM蛋白在许多生物学过程中起重要作用。生物信息学分析发现，稻瘟病菌基因组中含4个具有LIM结构域的蛋白，分别为：MoPax1、MoLrg1、MoLrg2和MoLdp1。基因敲除实验表明，△mopax1突变体在CM培养基上生长极其缓慢，不能产生分生孢子，也不能形成附着胞，且对感病寄主致病能力丧失；△molrg1突变体生长缓慢，可产生极少量的畸形孢子，且△molrg1突变体的孢子不能形成附着胞，对感病寄主也无致病性。△molrg2突变体产生长形孢子，在疏水表面只能形成少量附着胞，但在植物表皮组织能够正常产生附着胞并侵染寄主；△moldp1突变体则无明显的表型变化。将完整的基因分别导入相应突变体进行基因互补实验，上述突变体的表型缺陷均可以恢复。进一步将LIM蛋白C端融合GFP，并通过激光共聚焦显微镜观察和蛋白定位分析表明，MoPax1-GFP位于整个细胞基质，而MoLrg1-GFP和MoLrg2-GFP定位于细胞隔膜孔。由于MoLrg1含多重结构域，并在稻瘟病菌形态分化和致病性中起关键作用，进一步构建了各个结构域分别缺失的互补载体，转化△molrg1突变体，实验结果发现LIM2(MoLrg1的第二个LIM domain)和RhoGAP结构域对MoLrg1的功能和蛋白定位是必需的，而LIM1仅影响MoLrg1蛋白定位。采用酵母双杂交技术对稻瘟病菌MoLdb1和LIM蛋白进行蛋白互作实验，结果未发现它们之间存在直接的互作关系。此外，实验还鉴定了稻瘟病菌的重要转录调控因子MoSom1和MoCdtf1，它们可形成复合体并作用于cAMP-PKA途径的下游调控稻瘟病菌的形态分化和致病性；表型和基因转录表达谱分析结果显示，稻瘟病菌MoLdb1与MoSom1存在遗传关系。上述研究结果表明，含LIM结构域蛋白MoPax1和MoLrg1在稻瘟病菌形态分化和致病性中起重要作用。